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硕士论文-繁殖与呼吸综合征病毒SD2株ORF5/ORF6双基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达，共76页，38425字
摘要
为了揭示山东省流行的 PRRSV 的来源及遗传学背景，并为山东省 PRRS 的防治
提供一种安全有效的疫苗，本研究对 PRRSV SD2 株的 ORF5、ORF6 进行了测序，根
据哺乳动物细胞真核表达载体 pIRES MCSA MCSB 多克隆位点的序列和猪繁殖与呼
吸综合征病毒 SD2 株 ORF5、ORF6 基因阅读框架，同时考虑外源基因的表达量在基
因起始密码子的前面加入 Kozak 序列，分别设计了针对 ORF5、ORF6 的引物 P5s/P5r，
P6s/P6r。pIRES 和 ORF6 PCR 产物经 Nhe I 和 EcoR I 双酶切后，连接构建 pIRES－
ORF6。pIRES－ORF6 和 ORF5 PCR 产物经 Xba I 和 Not I 双酶切后，连接构建 pIRES
－ ORF5ORF6。经 PCR、双酶切鉴定和测序证明成功构建了转移载体 pIRES－
ORF5ORF6。
将构建成功的 pIRES-ORF5ORF6 转移载体用脂质体法转入稳定表达细胞 CHO，
经 G418 加压筛选获得稳定表达的细胞株，以 RT-PCR、SDS-PAGE、Western-Blot 和
间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。结果表明：经 RT-PCR 检测到两种目的基因
的转录；SDS-PAGE 检测到同时表达的两种目的蛋白； Western-Blot 证实表达的两种
蛋白具有免疫活性； 间接免疫荧光试验检测到目的蛋白在细胞浆和细胞核中观察到
了特异性的亮绿色荧光，证明蛋白得到表达。
为了弄清我国福建地区 PRRSV 的来源以及遗传学背景，为疫苗研制提供理论依
据，本研究对我国福建地区的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料 125 份进行检测，将阳
性病料所测的 10 株序列与北美洲原型（VR-2332 株）、欧洲原型（LV 株）和部分国
内外分离株的相应片段进行同源性比较。10 株序列明显可分为两个大的亚组，亚组
间的核苷酸同源性为 88%，组间分别为 91%－100%和 99%－100%；4 株序列的核苷
酸与 VR-2332 的同源性为 99%－100%，另 6 株序列为 88%－100%；10 株序列与 LV
株同源性只有 64%；据核苷酸推导氨基酸的同源性分别为 97.6%－99.4%和 89.6%－
99.3%，与 VR-2332 的同源性在 87.8%以上，与 LV 株的同源性为 59.6%左右，由此
可见我国福建地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒仍属北美洲型。
有 4 个保守区域被鉴定出来（a.a. 40-57,67-90,103-120,129-163），在保守区域内
16 号与疫苗毒 MLV RespPRRS DENMARK，MLVRespPRRS Repro USA 氨基酸序列
完全相同，14、52、53 号分别有 1 个氨基酸替换。10 株序列全部鉴定出 3 个 N 基端
糖基化位点，一个亚组的高变区糖基化位点位于 a.a.33，另一亚组位于 a.a.35。据 ORF5
的影响毒株毒力的两个基因推导：1 株毒株可能为弱毒株，2 株毒株可能为毒力返强
株，7 株毒株可能为强毒株。
总之，本研究揭示了目前流行于山东省的 PRRSV 的来源及遗传学背景，成功构
建了能同时表达两种主要保护性抗原蛋白的真核表达载体，并在哺乳动物细胞 CHO
中成功表达，这在疫苗的研究中是一个很大的突破。本研究为 PRRS 亚单位疫苗的研
制奠定了理论和物质基础，将为 PRRS 的防治特别是急性 PRRS 的防治带来新的技术
手段；系统的研究了我国福建地区 PRRSV ORF5 序列的遗传变化和系统发育关系。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 SD2 株
E、M 蛋白
哺乳动物细胞
表达
ORF5 序列遗传变化和系统发育关系
目录
前言……………1
中文摘要……………3
英文摘要……………5
第一部分 文献综述
综述一
PRRSV 分子生物学研究进展…7
1. 病毒分子生物学研究…………………7
2. 分子生物学诊断11
3. PRRSV 疫苗的研究…………………12
4. 展望……………19
第二部分 研究报告
试验部分Ⅰ
试验一
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）SD2 株 ORF5/ORF6 双基因真核表达载
体的构建…………20
1. 材料与方法…21
2. 结果…………26
3. 讨论…………30
试验二
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SD2 株 ORF5/ORF6 双基因真核表达载体
在哺乳动物细胞中的表达……………33
1. 材料与方法…34
2. 结果…………37
3. 讨论…………41
试验部分 Ⅱ
试验三 10 株猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5 序列的遗传变化和系统发育关系
4. 材料与方法…44
5. 结果…………44
6. 讨论…………49
结论………………50
参考文献…………51
附表 A PRRS 相关缩略语………………59
附表 B 溶液的配置61
附表 C 阳性病料背景……………………64
致谢………………65