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硕士论文-马铃薯Y病毒CP基因片段dsRNA原核表达及其诱导抗性，共68页，33399字
摘要
转录后基因沉默是植物自身抵抗植物病毒侵染的一种保护机制，实践证明通过转基
因在植物体内表达植物病毒的某个完整基因或者基因部分片段的双链 RNA(dsRNA)均
能获得高抗的转基因植株。也有研究表明在植物体外表达或合成植物病毒某个完整基因
的 dsRNA，也能诱导植物提高自身对病毒的抗性。但在体外表达仅含有植物病毒部分基
因片段的 dsRNA，能否也能诱导植物的抗病性还未见报道。
本研究以马铃薯 Y 病毒坏死株系 CP 基因为基础，以 L4440 为载体构建了两个含有
部分 PVYN-CP 基因片段的 dsRNA 原核表达载体，将其转化大肠杆菌菌株 HT115（DE3），
获得了相应的转化体，诱导表达产生了相关的 dsRNA，并对产生的 dsRNA 进行了诱导
抗病毒试验，主要结果如下：
1、RT-PCR 获得了 PVYN-CP 全长基因序列，并以此为基础构建了含有 PVYN-CP 基
因 5’ 端 264bp 和 中 间 253bp 的 反 向 重 复 两 个 原 核 表 达 载 体 LL-LS-L4440 和
ML-MS-L4440；
2、将其分别转化大肠杆菌菌株 HT115，获得了相应的转化体。含有 ML-MS-L4440
的转化体经过 IPTG 诱导表达，获得了相应的 dsRNA，并通过在不同时间添加 IPTG，
确定了高产 dsRNA 的 IPTG 最佳诱导时期；通过比较不同的 dsRNA 提取方法，最终确
定了 LiCl 沉淀法提取 dsRNA 比较理想。
3、用表达 dsRNA 的灭活细菌液和 dsRNA 提纯液及其 100 倍稀释物处理烟草进行
攻毒的试验，结果证明表达 dsRNA 的灭活细菌溶液和 dsRNA 提纯液及其 100 倍稀释物
均能降低 PVYN 在烟草体内的含量，减轻 PVYN 对烟草的为害,表明含有 PVYN-CP 部分
基因片段的体外表达的 dsRNA 能够诱导植物对病毒产生抗病性。
上述结果证实利用转录后基因沉默机制，构建含有部分植物病毒基因片段的原核表
达载体，在特定的细菌菌株中诱导表达相应的 dsRNA，用其灭活的细菌溶液和 dsRNA
提纯液处理烟草，可诱导植物的病毒的抗性，这为诱导植物抗病毒的策略的制定奠定了
基础，对植物病毒的防治具有广阔应用前景和实践意义。
关键词:马铃薯 Y 病毒；转录后基因沉默；双链 RNA；CP 基因；载体构建
目 录
摘要. Ⅰ
英文摘要............... Ⅱ
第一章 前言........... 1
1.1 植物病毒病及其防治 .............. 1
1.2 转录后基因沉默.................. 2
1.2.1 转录后基因沉默的发现 .......... 2
1.2.2 转录后基因沉默的诱导 .......... 2
1.2.2.1 转基因诱导的 PTGS ........... 2
1.2.2.2 病毒诱导的 PTGS ............. 3
1.2.2.3 dsRNA 直接诱导的 PTGS........ 4
1.2.3 转录后基因沉默的机制 .......... 4
1.2.3.1 RNA 阈值模型................ 4
1.2.3.2 异常 RNA 模型 ............... 5
1.2.3.3 双链 RNA 模型 ............... 6
1.3 利用 dsRNA 防治植物病毒病的研究进展..................... 8
1.3.1 转基因植物中转基因转录产生的病原 dsRNA 分子抗病毒..... 9
1.3.2 非转基因植物中体外转录出的病原 dsRNA 分子抗病毒...... 10
1.3.3 非转基因植物中体外表达的病原 dsRNA 分子抗病毒........ 11
1.4 本研究的目的与意义 ............. 12
第二章 马铃薯 Y 病毒 CP 基因片段反向重复原核表达载体的构建 ... 13
2.1 材料 ....... 13
2.1.1 病毒毒源 .................... 13
2.1.2 菌株、质粒和主要试剂 ......... 13
2.2 方法....... 13
2.2.1 目的片段的获得 .............. 13
2.2.1.1 引物设计................... 13
2.2.1.2 引物的稀释 ................ 14
2.2.2 烟草叶片总 RNA 的提取（酸性酚法） ................... 14
2.2.3 cDNA 的合成.................. 15
2.2.4 本研究 PCR 反应体系及反应条件 . 15
2.2.5 目的 DNA 片段的回收 .......... 16
2.2.5.1 电泳胶回收（冻溶法）....... 16
2.2.5.2 乙醇沉淀回收 .............. 16
2.2.6 质粒 DNA 的提取 ............. 16
2.2.6.1 质粒 DNA 的少量提取 .......... 16
2.2.6.2 质粒 DNA 的大量提取 .......... 17
2.2.7 DNA 浓度的测定 ................. 18
2.2.8 目的 DNA 的酶切 .............. 18
2.2.8.1 PCR 产物片段 ML 的 BamHI 和 SmaI 酶切 ............... 18
2.2.8.2 质粒 DNA 的酶切 ........... 18
2.2.9 质粒 DNA 与目的 DNA 片段 ML 的连接 ..................... 19
2.2.10 感受态细胞的制备 .............. 19
2.2.11 质粒 DNA 向大肠杆菌中的转化 ... 20
2.2.12 重组质粒的鉴定 ................ 20
2.2.12.1 Cracking 电泳初步筛选 ..... 20
2.2.12.2 PCR 鉴定.................... 20
2.2.12.3 少量提取重组质粒 DNA 的酶切鉴定 ................. 21
2.2.12.4 大量提取重组质粒 DNA 的酶切鉴定 ................. 22
2.2.13 重组质粒 ML-L4440 和片段 MS 的 KpnI 和 SmaI 酶切 ........ 22
2.2.14 重组质粒 ML-L4440 与目的 DNA 片段 MS 的连接 .......... 22
2.2.15 重组质粒 LL-LS-L4440 的构建 .. 22
2.3 结果与分析 ................... 22
2.3.1RT-PCR 结果................... 23
2.3.1.1RNA 提取 ................... 23
2.3.1.2 RT-PCR .................... 23
2.3.2 重组质粒 MS-ML-L4440 载体的构建 ..................... 24
2.3.2.1 目的基因片段的获得和酶切... 24
2.3.2.2 片段 ML 和 L4440 的连接及重组质粒的筛选 ............. 25
2.3.2.3 MS 片段与重组质粒 ML-L4440 的连接.................. 26
2.3.3 载体 LS-LL-L4440 载体的构建 ... 28
2.3.3.1 目的基因片段的获得和酶切... 28
2.3.3.2 片段 LL 和 L4440 的连接及重组质粒的筛选 ............. 28
2.3.3.3 LS 片段与重组质粒 LL-L4440 的连接.................. 30
第三章 dsRNA 的诱导表达和烟草攻毒试验 ..................... 32
3.1 材料和方法 .................... 32
3.1.1 材料 .. 32
3.1.2 dsRNA 的诱导表达 ............. 32
3.1.3 dsRNA 的提取方法 ............. 32
3.1.3.1 CTAB 法 ................... 32
3.1.3.2 LiCl 沉淀法 .................. 32
3.2.烟草攻毒试验 ..................... 33
3.2.1 设计处理 . 33
3.2.2 接种方法 . 33
3.2.3 检测方法 . 33
3.3.结果与分析 . 34
3.3.1 dsRNA 的诱导表达和提取 ......... 34
3.3.1.1 dsRNA 的诱导和提取 ............ 34
3.3.1.2 不同提取方法比较 ............. 34
3.3.1.3 不同细菌浓度诱导 dsRNA 的比较 . 35
3.3.2 烟草攻毒试验 ................... 37
3.4 结论与讨论 . 38
3.4.1 结论 .. 38
3.4.2 讨论 .. 39
3.4.2.1 植物病毒相关基因部分片段 dsRNA 原核表达载体的构建 .. 39
3.4.2.2 dsRNA 的诱导表达、提取和保存 ..................... 39
3.4.2.3 dsRNA 产物的烟草攻毒试验 ... 40
参考文献 ....... 41
附录Ⅰ ......... 45
附录Ⅱ ......... 47
致谢 ........... 51