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硕士论文-农杆菌介导花生遗传转化条件的研究，共52页，24658字
摘 要
花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油料作物和经济作物，但由于花生遗传基础狭
窄、抗逆性差，易感多种病虫害，尤其是褐斑病、黑斑病、网斑病等真菌性病害，严重
影响其产量和质量。本研究以广谱抗真菌性的 β-1, 3-葡聚糖酶基因为目的基因进行了花
生遗传转化。首先以花生幼叶为外植体进行培养，建立了花生幼叶高频再生体系；然后
以此体系为培养基础对农杆菌介导的花生遗传转化影响因素进行了研究，并将 β-1, 3-葡
聚糖酶基因转入花生，获得了转基因植株，结果如下：
1. 用花生品种花育 22 和花育 23 作材料，将种子萌发 5-7 d 的幼叶切块培养在添加
NAA 和 BAP 的 MSB5 培养基上诱导不定芽的形成，结果表明 MSB5+ 1 mg/L NAA+ 6.0
mg/L BAP 培养基最有利于不定芽的诱导，花育 22 和花育 23 不定芽诱导率分别达到 94%
和 90%。将形成不定芽的愈伤组织转移到添加 BAP 的 MSB5 培养基上促使芽伸长进一
步长成小苗，结果表明 MSB5 + 4.0 mg/L BAP 的培养基最为有效，花育 22 和花育 23 植
株诱导率分别达到 89.6%和 91.8%。将再生小植株从基部切下转至生根培养基上，使其
生根长成完整植株。在 MSB5+ 0.5 mg/L NAA 培养基上生根效果较好。
2. 利用花育 22 和花育 23 幼叶为受体材料，对农杆菌介导的花生遗传转化条件进
行了研究。农杆菌选用 LBA4404 和 EHA105，质粒为表达载体 pATC940 含有 β-1, 3-葡
聚糖酶基因和 Km 抗性基因。确立的转化条件为：Km 筛选压为 50 mg/L，预培养时间
为 2 d，菌液侵染浓度 OD600=0.5，外植体侵染时间为 10-15 min，共培养时间为 3 d。
3. 将 Km 抗性再生植株经 PCR 检测扩增出了与目的基因片段大小相同的条带，证
明获得了 β-1, 3-葡聚糖酶基因的花生转化植株。
关键词：花生（A. hypogaea L.）；组织培养；遗传转化；根癌农杆菌；β-1, 3-葡聚
糖酶基因（BG2）
目 录
中文摘要.... ..ⅰ
英文摘要........ⅱ
前言....... .........1
1 立题依据及意义........... ..... .1
2 文献综述...... ...... ....2
2.1 花生组织培养与植株再生的研究进展.... ...... .......2
2.1.1 器官发生途径的植株再生.... ......... ..........2
2.1.2 胚胎发生途径的植株再生..... ....... 3
2.2 花生遗传转化研究现状...... 4
2.2.1 农杆菌介导法......... .......... 4
2.2.2 基因枪法.. . 6
2.2.3 电击穿孔法.. ......... 6
2.2.4 花粉管通道法..... .. 6
2.3 β-1,3-葡聚糖酶作用及其研究进展 .......... 7
2.3.1 β-1,3-葡聚糖酶的性质...... 7
2.3.2 β-1,3-葡聚糖酶在植物抗病中的作用...... 8
2.3.3 转 β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展. 9
材料与方法... ........... 10
1 花生幼叶离体培养及植株再生... ........... 10
1.1 植物材料.... 10
1.2 试验方法....... ........ 10
1.2.1 基本培养基和培养条件......... .... 10
1.2.2 不同激素配比对外植体不定芽诱导的影响.... . 10
1.2.3 不定芽伸长培养. 10
1.2.4 生根培养........... .. 10
2 农杆菌介导的花生遗传转化的研究........ .......... 12
2.1 实验材料. .. 12
2.1.1 植物材料. 12
2.1.2 菌株和质粒......... 12
2.1.3 培养基..... 12
2.1.4 试剂配制. 13
2.1.4.1 抗生素的配制... 13
2.1.4.2 质粒提取所需试剂...... 13
2.1.4.3 植物基因组提取试剂.. 13
2.1.4.4 DNA 电泳所需试剂....... 14
2.2 实验方法.... 14
2.2.1 农杆菌感受态的制备及转化 ..... 14
2.2.2 农杆菌质粒 DNA 的提取.. ........... 14
2.2.3 转化农杆菌的 PCR 鉴定...... ....... 15
2.2.4 花生的遗传转化、筛选和再生........ ..... 15
2.2.4.1 Km 浓度的筛选......... ..... ..........15
2.2.4.2 侵染用农杆菌菌液的制备........... ...... 16
2.2.4.3 外植体的侵染及培养...... .. .....16
2.2.4.4 抗性植株的再生......... 16
2.2.5 花生基因组 DNA 的提取....... ..... ..16
2.2.6 转化植株的 PCR 检测......... ...... 17
结果与分析......... ..... 18
1 花生幼叶离体培养植株再生体系的建立......... .. 18
1.1 不同激素配比对外植体不定芽诱导的影响......... 18
1.2 不定芽伸长及植株再生......... ...... 19
1.3 再生苗的生根......... .......... 19
2 农杆菌介导的花生遗传转化条件研究......... ...... 21
2.1 转化农杆菌的分子鉴定......... ....... 21
2.1.1 农杆菌质粒 DNA 的提取......... .... 21
2.1.2 转化农杆菌的 PCR 检测......... .... 21
2.2 Km 对花生幼叶不定芽诱导的抑制效果 .. 22
2.3 预培养时间对花生幼叶 Km 抗性芽诱导的影响........... ..24
2.4 菌液浓度对花生幼叶 Km 抗性芽诱导的影响.. ..... .........24
2.5 侵染时间对花生幼叶 Km 抗性芽诱导的影响........... ..... 25
2.6 共培养时间对花生幼叶 Km 抗性芽诱导的影响.......... .. 27
2.7 抗性植株的分子检测......... .......... 27
讨论.......... 29
1 影响花生幼叶离体再生因素的研究......... ......... 29
2 影响农杆菌转化效率因素的研究......... . 29
2.1 Km 筛选压的确定......... ..... 29
2.2 预培养时间对转化的影响 29
2.3 菌液浓度对转化的影响......... ...... 30
2.4 侵染时间对转化的影响......... ...... 30
2.5 共培养对转化的影响......... .......... 30
结论.......... 32
1 花生幼叶植株再生体系的建立......... ...... 32
2 农杆菌介导花生遗传转化技术体系的优化......... .......... 32
3 转 β-1, 3-葡聚糖酶基因花生植株的获得 .......... 32
参考文献......... ......... 33
图版.. 37
附录.. 38
致谢...39