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  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:生物化学与分子生物学
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资料简介
硕士论文-利用RP-HPLC分离小麦醇溶蛋白和高分子量谷蛋白亚基的研究,共81页,38275字
摘 要
麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白亚基作为小麦贮藏蛋白的重要组成部分,其组成和
含量对小麦面粉的烘烤品质有重要影响。近年来随着小麦胚乳贮藏蛋白研究的不断深
入,麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白亚基的分离纯化成为热门研究领域。现代分子生物
技术的发展以及一些先进的分离手段的出现,大大促进了小麦贮藏蛋白的研究。其中反
相高效液相色谱技术的发展为我们提供了快速分离和定量分析小麦贮藏蛋白的有效方
法。本研究旨在建立小麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白亚基有效分离鉴定的反相高效液
相色谱法,同时分析长期定位施肥下冬小麦烟优 361 的麦醇溶蛋白和高分子量麦谷蛋白
亚基的变化,为通过改变施肥水平提高小麦品质,提供理论依据。主要研究结果如下:
1.本研究系统分析了洗脱时间、色谱柱温度、流速、洗脱梯度、蛋白提取方法等对利
用反相高效液相色谱法分离小麦醇溶蛋白的影响,利用反相高效液相色谱柱(ZORBAX
300SB-C18 Stable Band Analytical 4.6x150mm, 5-Micron)和 Aglient 1100 高效
液相色谱系统,建立了适合我国小麦醇溶蛋白分析的反相高效液相色谱技术体系。
该体系的主要参数包括:利用 0.05M NaCl→H2O→70%乙醇的三步提取法、柱温 60°C、
流速 1.0ml/min、进样量 15μl、洗脱梯度 55 min 内流动相 B 的体积比由 21%升到 48%
(v/v)。本研究结果表明,RP-HPLC 可作为利用小麦醇溶蛋白鉴定不同小麦品种的可
靠方法。
2. 本研究系统分析了洗脱时间、色谱柱温度、流速、洗脱梯度等对利用反相高效液相色
谱法分离小麦高分子量谷蛋白亚基的影响,利用反相高效液相色谱柱(ZORBAX
300SB-C18 Stable Band Analytical 4.6x150mm, 5-Micron)和 Aglient 1100 高效
液相色谱系统,建立了适合我国小麦 HMW-GS 的反相高效液相色谱技术体系。该体系
的主要参数包括:柱温 60°C、流速 1.0ml/min、进样量 15μl、洗脱梯度 30 min 内流
动相 B 的体积比由 21%升到 36%(v/v)。本研究结果表明,RP-HPLC 可作为小麦品质
改良中优质亚基鉴定筛选的有力工具。
3.本研究利用反相高效液相色谱技术分析了 26 年长期定位施肥条件下的烟优 361 麦醇
溶蛋白的变化,结果表明:麦醇溶蛋白的亚基组成数量不受施肥水平的影响,但是亚
基含量有所差异。ω-醇溶蛋白受肥力水平的影响较小,除 N2PK 条件使其含量降低
外,其他 10 个处理与对照相比变化很小。γ-醇溶蛋白、α/β-醇溶蛋白受环境影响
较大,在 N1、N2、M1N1、M1N2、M2N1、M2N2、N2P、N2K 八种处理时蛋白含量与对照相比显
著增加,M2、N2PK 施肥水平与对照相比能减少其含量。N1 施肥水平 γ-醇溶蛋白增幅
最大,N2P 处理时 α/β-醇溶蛋白与对照相比增幅高达 215.8%。
4.本研究利用反相高效液相色谱技术分析了 26 年长期定位施肥条件下的烟优 361 高分
子量麦谷蛋白亚基的变化结果表明:1Dx5、1Dy10、1Bx17、1By18、1Ax1 在 12 个不
同处理间的变化趋势基本一致,受不同肥力处理的影响较大。在 N1、N2、M2N2、N2P、
N2K 五种肥力条件,优质蛋白亚基 1Dx5、1Dy10、1Bx17、1By18 与对照相比均有较大
提高,当土壤中氮素含量为 138kg.hm-2 时含量最高。
关键词:麦醇溶蛋白,高分子量麦谷蛋白亚基,反相高效液相色谱,长期定位施肥
目 录
中文摘要 ........... ⅰ
英文摘要 ........... ⅲ
缩写词 . Ⅴ
综述 . 1
1.小麦贮藏蛋白的组成. 1
2.小麦高分子量谷蛋白 2
2.1 HMW-GS 的基因定位及变异...... 2
2.2 HMW-GS 与小麦品质的关系....... 3
3.小麦醇溶蛋白 ...... 4
3.1 麦醇溶蛋白的分子特征 ......... 5
3.2 麦醇溶蛋白与小麦品质的关系.... 5
4.小麦贮藏蛋白的分离分析方法 ..... 5
4.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ........ 6
4.2 酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳........ 6
4.3 双向电泳(A-PAGE×SDS-PAGE 、IEF×SDS-PAGE) .......... 7
4.4 高效毛细管电泳 ... 7
4.5 高效液相色谱 ..... 8
4.6 质谱(Mass Spectrometry, MS)技术 ......... 9
5.反相高效液相色谱在小麦贮藏蛋白分离纯化中的应用 ......... 10
6.不同施肥水平对小麦产量及其品质的影响....... 12
7.本研究的基本思路和目标 ........ 13
7.1 小麦醇溶蛋白和高分子量谷蛋白亚基 RP-HPLC 分离法的建立 .. 13
7.2 不同施肥条件下小麦贮藏蛋白亚基组成的变化 . 14
材料与方法 ......... 15
1.实验材料 ......... 15
2.仪器设备 ......... 15
3.试验试剂 ......... 15
4.实验程序 ......... 16
4.1 试剂配制 ....... .16
4.2 高效反相液相色谱试验方法..... 17
4.3 不同施肥种类和数量的试验设计 17
4.4 不同施肥种类和数量的试验方法 17
研究内容与结果分析.. 19
1.小麦醇溶蛋白 RP-HPLC 方法的建立 19
1.1 小麦籽粒醇溶蛋白质提取方法的确定 ......... 19
1.2 洗脱梯度的确定 .. 20
1.3 色谱柱温度对分离结果的影响... 21
1.4 洗脱时间对分离效果的影响..... 21
1.5 流速对分离效果的影响 ........ 22
1.6 试验方法的稳定性 23
1.7 不同小麦品种及小麦近缘种的 RP-HPLC 分离 ... 23
2.小麦 HMW-GS 的 RP-HPLC 方法的建立 .......... 28
2.1 小麦籽粒 HMW-GS 的提取方法.... 28
2.2 色谱柱温度对分离效果的影响... 28
2.3 洗脱梯度及时间的确定 ........ 29
2.4 流速对分离效果的影响 ........ 31
2.5 不同小麦品种及小麦近缘种的 RP-HPLC 分离 ... 32
3.不同施肥种类和数量小麦烟优 361 醇溶蛋白和 HMW-GS 的 RP-HPLC 分析...... 40
3.1 不同施肥种类和数量小麦烟优 361 醇溶蛋白 RP-HPLC 分析.... 40
3.2 不同施肥种类和数量小麦烟优 361HMW-GS 的 RP-HPLC 分析.... 48
讨论 ... 54
1.小麦醇溶蛋白 RP-HPLC 分离分析 .. 54
2.小麦 HMW-GS 的 RP-HPLC 分离分析 . 55
3. RP-HPLC 与电泳方法的比较分析.. 56
4.不同施肥种类和数量条件下冬小麦烟优 361 的 RP-HPLC 分析 ... 56
结论 ... 58
参考文献 ........... 59
致谢 ... 66
导师组意见 ......... 67
学位论文独创性声明.. 68
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