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硕士论文-牛卵母细胞体外成熟过程中核迁移及体外发育的研究，共66页，29839字
摘 要
本试验研究采用地衣红染色方法，对直径为 2-8mm 牛卵泡卵母细胞体外成熟过程中核
迁移过程进行了详细地研究；并通过体外受精，探讨了不同的培养体系对牛受精胚体外发
育的影响，为进一步研究牛卵母细胞减数分裂机制和调控以及改善牛早期胚胎培养体系提
供科学依据。
研究结果如下：
1、探讨了卵巢性周期、卵丘细胞、成熟培养时间以及牛卵泡液（bFF）对牛卵母细
胞体外成熟的影响。结果表明：均得可用卵子数卵泡期卵巢（7.00）极显著高于黄体期
卵巢（3.12）（P<0.01），卵泡期卵母细胞核成熟率（80.35%）显著高于黄体期卵母细胞
（71.70%） P<0.05 ；卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的质量影响卵母细胞的体外成熟，
A、B 级卵母细胞成熟率分别是 88.15%（186/211）和 68.54%（122/178），两者差异显
著（P<0.05）；将随机分成三组的卵母细胞分别培养 18h（Ⅰ组）、22h（Ⅱ组）和 24h（Ⅲ
组），Ⅰ组成熟率（69.81%）显著低于Ⅱ组（79.41%）和Ⅲ组（82.93%）（P<0.05）；成
熟培养液中添加 10%的 bFF 对牛卵母细胞体外核成熟几乎没有影响，但高浓度的 bFF
（20%、30%）则抑制牛卵母细胞的体外成熟。本试验采用 TCM-199 成熟培养体系：
（TCM-199+3mg/mlBSA+2.5mg/mlTaurine+10μg/mlFSH+100IU/mlGentamycin+5%FBS）
能够有效支持卵母细胞体外核成熟，是牛卵母细胞体外成熟培养理想的培养体系。
2、采用传统的醋酸地衣红染色法，详细研究了直径 2-8mm 卵泡卵母细胞体外成熟
过程中细胞核迁移进程，结果发现牛卵母细胞的成熟分裂从 GVBD 开始，其细胞核逐
渐由卵母细胞近中央位置向卵母细胞皮质区迁移，之后同源染色体分开，排出第一极体。
卵母细胞成熟后，随着培养时间的延长，MⅡ期细胞核又逐渐远离第一极体端。应用面
积积分法处理，得到核成熟进程为：0-5.8h 为 GV 期，持续 5.8h；5.8-7.4h 为 GVBD 期，
持续 1.6h；7.4-9.8h 为 DK 期，持续 2.4h；9.8-15.1h 为 MⅠ期，持续 5.3h ；15.1-18.0h
为 AⅠ/TⅠ期，持续 2.9h ；18.0-24.0h 为 MⅡ期，持续 6h 。
3、对比了 TCM-199、CR1aa、SOF 和 mSOF 分步培养四种培养体系的培养效果，
并探讨了血清对其早期胚胎发育的影响。结果表明：2-细胞胚率和 8-细胞胚率 4 种培养
体系之间差异不显著，mSOF 分步培养体系的桑椹胚/囊胚的比率为 27.3%，显著高于
TCM-199 培养体系（17.8%） P>0.05） 与 CR1aa 培养体系（23.6%）差异不显著，SOF
培养体系的桑椹胚/囊胚的比率仅仅为 3.0％，与其他三组差异极显著（P<0.01）；在筛选
出的 mSOF分步培养体系中 72h后用 5%FBS替代 BSA，以及在培养的全过程中用 5%FBS
替代 BSA 所得的 2-细胞、8-细胞及桑椹胚/囊胚率均与对照组（无血清组）差异不显著
（P>0.05）。
关键词：卵母细胞； 体外成熟； 核迁移； 体外培养； 牛
目录
中文摘要……ⅰ
英文摘要……ⅲ
缩略符号……ⅴ
第一部分 文献综述 1
第一章
牛卵母细胞体外成熟过程中细胞核迁移的研究进展.. 1
卵母细胞核迁移的研究概况.. 1
细胞核迁移的研究方法. 2
卵母细胞体外成熟过程中 GVM 的机理与分子生物学特点..... 3
存在问题及解决方法..... 4
应用前景 . 5
第二章 牛早期胚胎体外培养的研究进展 ........ 6
早期胚胎发育的基础培养液 6
基础培养液中其它成分的添加及功用.... 6
培养方法. 10
前景与展望...... 11
第二部分 试验研究 ….…12
第三章 牛卵母细胞体外核成熟影响因素的研究.... 12
3.1 材料...... 12
3.1.1 主要试剂.. 12
3.1.2 仪器设备.. 12
3.1.3 试验所用的溶液........ 13
3.2 方法...... 13
3.2.1 卵巢的采集、运输.... 13
3.2.2 检卵管的制作... 13
3.2.3 卵丘-卵母细胞复合体的采集 .... 13
3.2.4 卵泡液的制备... 13
3.2.5 卵母细胞的选择........ 14
3.2.6 试验设计.. 14
3.2.7 卵母细胞体外成熟培养..... 14
3.2.8
3.2.9
卵母细胞的体外成熟及品质鉴定 ....... 14
统计分析.. 15
3.3 结果...... 15
卵巢性周期对卵母细胞体外核成熟的影响 15
卵丘细胞对卵母细胞体外核成熟的影响 .... 15
培养时间对卵母细胞体外成熟的影响 ........ 15
bFF 对卵母细胞体外核成熟的影响 ... 16
讨论.... 19
第四章 牛卵母细胞体外成熟过程中核迁移的研究 21
材料.... 21
4.1.1 主要试剂.. 21
4.1.2 仪器设备.. 22
方法.... 22
卵巢的来源和处理.... 22
4.2.2 卵母细胞的收集与成熟培养...... 22
4.2.3 卵母细胞的细胞核染色..... 23
4.2.4 卵母细胞核减数分裂时相的判定 ....... 23
结果.... 23
细胞核迁移过程........ 23
牛卵母细胞体外核成熟的时间进程 ... 23
讨论 ....... 29
第五章 不同培养体系对牛胚胎体外发育的影响.... 30
5.1
材料.... 30
5.1.1 主要试剂.... 30
5.1.2 仪器设备.. 30
5.1.3 溶液的配制....... 31
5.2方法.... 31
5.2.1 卵母细胞的采集与成熟培养...... 31
5.2.2 体外受精（IVF）........ 31
5.2.3 受精卵的体外培养...... 32
5.2.4 试验设计.... 32
5.2.5 统计分析.... 32
5.3 结果...... 32
5.3.1 不同培养液对牛受精卵体外发育的影响 ...... 32
5.3.2 FBS 对牛受精卵体外发育的影响 34
5.4 讨论...... 36
结论....... 39
参考文献....... 40
附录 46
致谢 48
攻读硕士论文期间发表的学术论文 .. 49
导师组意见... 50
学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书.. 51