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硕士论文-鹅A－FABP基因克隆与多态性分析，共70页，34448字
摘要
脂肪型脂肪酸结合蛋白（Adipocyte Fatty Acid-Binding Proteins，A-FABP）是脂肪酸结合
蛋白中的重要因子，在哺乳动物中只在脂肪组织中表达。哺乳动物的 A-FABP 是甘油三酯的
贮存库，在甘油三酯的形成以及脂溶解的过程中 A-FABP 储存或释放出大量的脂肪酸，还具
有调节作用：影响细胞内信号转导和基因转录；改变细胞内氧化还原电位；改变细胞内与代
谢相关的酶的活性；增加脂肪酸在膜间的扩散，从而参与调控脂生成及溶解的生化循环。
本试验以五龙鹅和朗德鹅为研究对象，克隆了 A-FABP 基因内含子 2 和 3 的完整序列，
并用 3 种不同的酶酶切 PCR 产物，与鹅的肥肝性能进行统计分析，对其内含子 3 的序列进行
同源性分析和酶切分析，并利用 Real-time PCR 技术检测了 A-FABP 基因在脂肪、肝、腿肌等
10 种组织中的表达情况。结果如下：
1 根据鸡（AF432506）、鸭（DQ358123）、人（NM001442）、猪（SSY16039）等的 A-FABP
基因保守序列设计引物，运用 PCR 法从五龙鹅和朗德鹅血液中克隆了 A-FABP 基因内含子 2
序列，长 461bp（GenBank 登录号为 DQ647701）。并用 RFLP 的方法对其进行遗传多态性研
究，该扩增产物经 AspⅠ、HinfⅠ和 HaeⅢ酶切后，发现有 HaeⅢ-RFLP，并出现 AA、AB 和
BB 3 种基因型，其五龙鹅和朗德鹅的基因型频率分别为 0.7、0.2、0.1 与 0.372、0.465、0.163。
经 χ2 检验，五龙鹅和朗德鹅在 A-FABP 位点上处于 Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05）。分
析基因型与鹅体重和肥肝性状时发现：基因型对五龙鹅体重无显著影响（P>0.05），而对填饲
的朗德鹅体重和肥肝性状有显著影响（P<0.05）。填饲的朗德鹅在体重和肥肝性状上基因型
AA 与 AB 和 BB 之间存在显著差异（P<0.05），而五龙鹅在体重性状上 3 种基因型差异不显
著（P>0.05）。在研究指标中两种鹅的 AA 基因型效应均大于 AB 和 BB 基因型。表明，这些
差异的不同可能反映了品种之间不同的遗传特性。A-FABP 可能是影响鹅肥肝性状的主效基
因或与主效基因相连锁，可用于更多鹅肥肝性状的标记辅助选择。
2 根据鸡的（AF432506）、鸭（DQ358123）等发表的编码区序列设计兼并引物，从五
龙鹅和朗德鹅基因组的 DNA 中克隆了包括内含子 3 的序列，长 1361bp（序列已提交
GenBank），其中完整的内含子 3 长 1278bp。鹅 A-FABP 基因内含子 3 与鸡的同源性达到了
75.0%。获得的序列与鸡相比发生了 60 个碱基缺失和 274 个碱基替换，鸡相对鹅发生了 51
个碱基缺失和 283 个碱基替换。通过对鹅 A-FABP 基因内含子 3 的基因组序列进行酶切分析
发现有 10 种常见的限制性内切酶的酶切位点 20 处，并且用分析软件表明该片断适合进行酶
3 根据已测得的不同动物 A-FABP 基因的保守区设计引物，提取朗德鹅脂肪、肝、心、
脾、肺、肾、胸肌、腿肌、睾丸、脑 10 种组织的 RNA，利用 Real-time PCR 技术检测了 A-FABP
基因在 10 种组织中的表达情况。最佳反应条件为：SYBR GreenⅠ终浓度为 1×，退火温度为
60℃时，此时，熔解曲线显示单峰且峰值单一。朗德鹅 A-FABP 基因在各组织中的表达量的
关系为：肝>脂肪>腿肌>脾>肺>心>胸肌>肾>睾丸>脑。表明肝脏和脂肪的表达量处在最高的
等级，腿肌、脾、肺、心处在第二等级，表达量次之，胸肌、肾、睾丸、脑处在第三等级，
有微量的表达。
关键词：鹅；A-FABP；肥肝重；体重；多态性；相关性
目 录
中文摘要……………… 1
英文摘要…… 3
缩略符号…………… 5
第一章 文献综述……… 6
1.1 综述前言………… 6
1 . 2 FA B P s 基 因 的 研 究 进 展 … … … … … … … … … … … … … … 6
1.3 A-FABP 基因的研究进展………8
1.4 A-FABP 基因变异与畜禽肉品质性状相关的研究……………10
1.5RFLP 作为畜禽肉质性状的分子标记的研究进展…… 12
第二章鹅 A-FABP 内含子 2 的多态性与体重及肥肝性状关系的研究…15
2.1 试验材料和方法15
2.1.1 试验材料……15
2.1.2质粒和菌株15
2.1.3 主要工具酶及试剂……………15
2.1.4 试验仪器16
2.1.5 所用溶液及其配制………17
2.1.6 试验方法18
2.2 结果与分析……………… 2 2
2.2.1 鹅血液 DNA 的提取………23
2.2.2 鹅 A-FABP 基因内含子 2 基因的扩增……………23
2.2.3 目的片段的转化及质粒 DNA 的 PCR 扩增检测…23
2.2.4 PCR 扩增结果与酶切分析……24
2.2.5 重组质粒的序列测定…………24
2.2.6 A-FABP 基因和基因型频率……25
2.2.7群体遗传平衡………………25
2.2.8 测序结果…25
2.2.9 A-FABP 基因型与肥肝性状的关系……………26
2.3 讨论…… 2 6
第三章
五龙鹅和朗德鹅 A-FABP 基因内含子 3 的克隆及序列分析……29
3.1 试验材料和方法………………29
3.1.1 试验材料……………… 2 9
3.1.2 试验方法……………… 2 9
试验结果分析………………30
3.2.1 五龙鹅和朗德鹅 A-FABP 基因内含子 3 的 PCR 扩增与鉴定…30
3.2.2 重组质粒的鉴定……………31
3.2.3 鹅 A-FABP 基因内含子 3 的基因测序结果及序列分析……………31
3.3 讨论………34
第四章
利用荧光实时定量 PCR 对鹅 A-FABP 基因的检测…………37
4.1 试验材料和方法………………37
4.1.1 试验材料…37
4.1.2 主要试剂………37
主要仪器……38
试验方法…39
4.1.5 鹅组织中总 RNA 抽提取………39
4.1.6 总 RNA 的逆转录反应…………40
重组质粒的构建………………40
标准曲线的制作………………41
Real-time PCR 检测 A-FABP 基因在组织中的表达量……………41
结果与分析41
4.2.1 鹅组织中 RNA 提取结果………42
4.2.2 标准曲线的制备……… 4 2
A-FABP 基因在组织中的表达量检测…………43
4.3 讨论…… 4 5
全文结论…… 47
参考文献…… 48
附录…… 53
致谢…… 59