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硕士论文-高光效植物总DNA导入小麦的研究，共71页，35684字
摘要
本试验采用花粉管通道法将玉米、稗草和螺旋藻的总 DNA 导入不同的小麦品种
（系）中，并对其后代的农艺性状表现、细胞学以及蛋白质方面的变异进行了研究，
结果如下：
对导入当代收获的种子的发芽率进行研究分析，发现处理后的种子的发芽率
低于对照，说明外源 DNA 的导入影响了小麦的发芽率。外源 DNA 的导入对
小麦的发芽势也有抑制作用，表现为外源 DNA 处理的小麦虽可发芽，但是
生长缓慢，甚至出现叶的失绿、卷曲等现象。原因可能是外源 DNA 的导入
使细胞内的某些酶发生变化，而这些酶对细胞的发芽率和发芽势有直接影
响。
对小麦品种 9411 处理后代农艺性状的观察发现，在用玉米 B 的 DNA 处理
的后代中，突变率比较高，总变异率高达 30%，其表现为芒性由有芒变为无
芒，植株高度出现变异，穗形也出现变异，由长方形变为纺锤形，此外还发
现了抗病性的变异。9411 的其他处理的变异率为 6%-10%。通过对 955159
的处理后代的农艺性状研究发现，各个处理的变异主要包括植株高度、芒性、
叶耳颜色、灌浆期叶绿素含量等方面，其中灌浆期 955159 各处理与受体相
比叶绿素含量的变化显著，955159 各个处理的变异率为 8%-15%。对鲁麦 21
和 96266 的处理后代表现相似，变异主要包括芒的有无、粗蛋白含量的变化，
穗形的变化，以及分蘖数的变化，其他方面的形态变化不显著。
对农艺性状变异的植株进行粗蛋白含量分析，发现在鲁麦 21 的各个处理中
相差显著，鲁麦 21 对照的粗蛋白含量为 18.62%，在导入玉米 A、玉米 B、
稗草和螺旋藻的 DNA 后的变异植株中分别发现了粗蛋白含量为 15.42%、
19.20%、12.37%、14.02%的变异个体。在高蛋白的 96266 中，其粗蛋白含量
为 21.11%，在其处理后代中筛选到 23.17%（玉米 B 处理）和 12.43%（玉米
A 处理)的超亲植株。
对导入当代收获的种子的根尖细胞的染色体进行检测，发现了两方面的变
异。一方面是根尖细胞染色体数目的变化，包括染色体数目的增加和减少。
染色体数目的减少比染色体数目增加的百分数稍大。另一方面是有丝分裂行
为的异常，包括染色体片段、染色体桥、染色体落后等，每一种异常分裂的
概率在 1%-2%。在本实验中还发现了体细胞联会现象，不过其染色体为 24
Ⅱ+Ⅰ，可以视为外源 DNA 导入的影响。
对 D0 代种子（D1）的谷蛋白电泳分析，发现处理后代中，在形态上发生了
变异的植株与形态上未发生变异的植株中均检测到谷蛋白的变异，变异主要
发生在高分子量的 γ 和 ω 区，不同的是在形态上发生了变异的植株中出现变
异的概率更大，说明利用农艺性状的选择来鉴定外源 DNA 导入的方法是可
行的，并且说明有一些变异需要通过采用分子生物学的方法进行检测。在对
玉米 B 的 DNA 处理小麦品种 9411 的变异株进行的谷蛋白检测中，各个不同
的变异株的种子的谷蛋白谱带大部分相同，但在同一植株的不同的种子中，
某些谷蛋白谱带的深浅不同，即谷蛋白含量的多少不同，说明通过外源 DNA
的导入确实能够改变受体的谷蛋白组成，并且对同一变异株的后代进行选
择，能够选择到谷蛋白组成相同但是各个谷蛋白组分相对含量不同的株系。
对 D0 代种子（D1）进行醇溶蛋白电泳分析，其电泳图谱的变异也是主要发
生在高分子量的 γ 和 ω 区，在以 9411 为受体的处理中，除了大部分与受体
9411 的电泳图谱相同外，还增加了三条新的电泳带，缺失了受体中的一条带；
在 D0 (鲁麦 21S) 的电泳图谱中，出现的变异也是发生在 γ 和 ω 区，说明外
源 DNA 的导入倾向于使较高分子量的蛋白质发生变异。在 D0 (96266B) 所
选择的形态变异单株的电泳图谱中，出现了谱带的增加与消失，也出现了谱
带深浅的变化。
关键词 花粉管通道法；外源 DNA；小麦；发芽势；染色体；谷蛋白；醇溶蛋白
目录
摘要.....1
Abstract .....3
第一章
综 述 ....i
1.1 外源 DNA 导入技术的研究进展 .1
1.2 外源 DNA 导入的理论基础以及 DNA 片段杂交假说的提出 ...3
1.3 小麦遗传转化技术..........4
1.4 花粉管通道法在育种中的应用...6
1.5 外源 DNA 导入后产生的变异特点 ........7
1.6 外源 DNA 导入技术的可行性 ....8
1.7 导入外源植物总 DNA 的检测方法 ........9
1.8 影响小麦后代转化率的因素 ....13
1.9 花粉管通道技术的特点 ..........13
1.10 花粉管通道技术的应用前景与展望 ....14
1.11 本研究的目的及意义 15
第二章 DNA 导入小麦后代农艺性状研究 .......17
2.1 材料和方法 .......17
2.1.1 供试材料 ........17
2.1.2 实验设计 ........17
2.1.3 供体 DNA 的提取 .......17
2.1.4 供体 DNA 的质量检测 ...........18
2.1.5 花粉管通法导入外源总 DNA .18
2.1.6 导入后代的田间种植 ..18
2.1.7 外源 DNA 导入后的种子发芽率 ........19
2.1.8 D1 叶绿素含量的测定 19
2.1.9 D1 粗蛋白含量的测定 19
2.2 结果与分析 .......19
2.2.1 外源 DNA 导入后的种子发芽率 ........19
2.2.2 D1 代产生的变异率 ....21
2.2.3 D1 代变异植株田间农艺性状表现 .....22
2.2.3.1 株高、穗长，有效分蘖数研究分析 22
2.2.3.2 旗叶叶长和叶面积 ..25
2.2.3.3 旗叶叶绿素的相对含量 ......27
2.2.3.4 芒的特性研究..........29
2.2.3.5 穗型研究 .....29
2.2.3.6 抗病性 .........31
第三章 DNA 导入小麦后代的细胞学研究 ..........35
3.1 材料与方法 .......35
3.1.1 试验材料 ........35
3.1.2 试验方法 ........35
3.2 结果与分析 .......36
3.2.1 根尖细胞的染色体计数.......... 36
3.2.2 根尖细胞的有丝分裂行为观察 .......... 39
第四章 DNA 导入后小麦蛋白质水平变异..... 41
4.1 材料与方法 ....... 41
4.1.1 试验材料........ 41
4.1.2 试验方法........ 41
4.1.2.1 溶液配制 ...... 41
4.1.2.2 操作步骤 ...... 42
4.1.2.3 小麦醇溶蛋白的电泳分析（参照傅宾孝的方法，略有改动） ..... 42
4.2 结果与分析 ....... 43
4.2.1 谷蛋白分析 .. 43
4.2.2 醇溶蛋白部分 46
第 五 章 讨 论 ......... 49
5.1 花粉管通道法在作物遗传改良中的可行性 ..... 49
5.2 外源总 DNA 导入的后代变异的丰富性和随机性....... 49
5.3 利用花粉管通道技术进行基因转化的关键 ..... 50
5.4 外源 DNA 处理后的种子出苗情况....... 50
5.5 外源 DNA 的瞬时表达 . 50
5.6 变异率偏低的原因 ....... 51
5.7 剪取根尖的时间 51
5.8 处理后不同植株的染色体数目统计结果......... 51
5.9 不同的预处理方法的效率不同 52
5.10 根尖染色体压片的局限性....... 52
5.11 不同的供体 DNA 的诱变作用不同的原因 ..... 52
5.12 谷蛋白电泳和醇溶蛋白电泳的比较... 52
致 谢
参考文献：.. 54