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资料简介
硕士论文-五龙鹅MHCⅠ基因克隆、组织表达及分子特性的研究,共89页,35190字
摘 要
主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是由紧密连锁的高
度多态的基因位点所组成的位于染色体上一个遗传区域,广泛存在于所有脊椎动物,具
有高度的多态性和保守性。该基因区编码的蛋白通常称为 MHC 分子或 MHC 抗原,是
移植排斥的主要决定簇。根据结构和功能可将 MHC 分为 I、II、III 三类。在结构上 I 类
分子可分成肽结合区、Ig 样区、跨膜区和胞浆区 4 个部位。国内外关于鹅免疫方面的研
究较少,本试验以我国优良的地方品种——五龙鹅为试验对象,主要研究五龙鹅 MHC
classⅠ基因分子特性,获得如下研究结果:
1 根据 GenBank 中鸡(XM_424372),鼠(AY064389),斑马鱼(BC066745)等的 MHC
classⅠ基因保守序列,使用 Primer Premier5.0 与 Oligo6.0 程序设计一对引物,利用反转
录-聚合酶链式反应( RT-PCR)从有丝分裂原刀豆蛋白 A (ConA)刺激 18h 活化的五龙鹅脾
细胞中扩增出相应大小的基因,经酶切鉴定和 PCR 鉴定,将目的片段与 pAT2 载体连
接,转化到 DH5α 感受态中,提取质粒,对序列进行测定,扩增出 1062bp 的基因,将
测得的序列递交到 GenBank 中,获得登陆号为:AM114925。
2 根据测得的基因 cDNA 序列,重新设计引物,提取基因组 DNA,利用 LA-PCR
方法从五龙鹅基因组 DNA中克隆了 MHC class I 类分子的基因组序列并分析其基因组结
构,经过酶切鉴定和 PCR 鉴定,获得五龙鹅的基因组 MHC class I 序列,共有 2594bp
个碱基,将测得的序列递交到 GenBank 中,获得登陆号为:AM114924。利用 ContigExpress
生物软件和 VecScreen 程序比较五龙鹅 MHC class I 的 DNA 序列和 cDNA 序列,发现鹅
MHC class I 含有 8 个外显子和 7 个内含子。
3 用 T aqMan 技术建立了一种实时 Realtime-PCR 的方法,用于检测鹅 MHC class I
基因,无菌采取鹅心肝、脾,肺、肾、胸腺、法氏囊、脑、肌肉和胚胎组织,进行实时
Realtime-PCR,该方法具有较好的敏感性和特异性,试验结果发现:MHC class I 基因在
鹅的组织中按不同的表达量关系为:法氏囊>脾脏>胸腺>脑>肺>肌肉>肾>心肌>胚胎>
肝,通过结果可发现免疫器官中 MHC class I 基因的表达量要比其它器官的高。
4 运用生物信息学的方法进一步分析了五龙鹅 MHC class I 基因核酸序列及氨基酸
序列(编号 WL MHC class I )。核酸 DNA 序列基因酶切图谱分析获得 21 种常见限制性内
切酶的酶切位点;WL MHC class I 蛋白分子量为 39074.69m.w,等电点 pI 为 5.53;蛋白
的疏水性为 3.433,在第 300-320 氨基酸的 C 端有一段较强的疏水区;有两个蛋白质超
家族,有 44.4%的可能存在于线粒体内。三维结构中由两个长的 α-螺旋,三个 β-折叠
构成,α-螺旋之间形成一个空间凹陷。与其他 16 个物种的氨基酸序列多序列比对的进
化树,表明鹅 MHC class I 与鸡有 64.1%的同源性,与鼠有 43.5~44.4%的同源性,与
人的有 42.9%同源性。
关键词:五龙鹅
MHC class I
分子克隆
组织表达
生物信息学
目录
中文摘要……ⅰ
英文摘要……ⅲ
缩略符号……ⅴ
文献综述.......... 1
1综述前言.. 1
2MHCⅠ分子结构与作用机理 ...... 2
3畜禽 MHC 的研究概况 ... 4
4MHC 与畜禽抗病性关系的研究 ............ 6
研究内容
1五龙鹅 MHC classⅠcDNA 基因克隆及序列分析............ 9
1.1 试验材料和方法.... 9
1.1.1 实验动物 9
1.1.2 质粒和菌株......... 9
1.1.3 主要工具酶及试剂.......... 9
1.1.4 试验仪器........... 10
1.1.5 所用溶液及其配制........ 11
1.1.6 五龙鹅 MHC classⅠcDNA 基因的扩增和测序......... 13
1.2 结果与分析........ 18
1.2.1 五龙鹅脾脏 Total RNA . 18
1.2.2 五龙鹅 MHC classⅠcDNA 基因扩增 18
1.2.3扩增条件的优化.......... 18
1.2.4 插入片段的转化.......... 18
1.2.5 插入片段的检测............ 19
1.2.6 重组质粒的序列测定..... 20
1.2.7 测序结果........... 20
1.3 讨论..... 21
2 五龙鹅 MHC classⅠ基因组 DNA 克隆及序列分析......... 23
2.1试验材料和方法:....... 23
2.1.1试验材料....... 23
2.1.2试验方法....... 23
2.2试验结果分析.. 24
2.2.1 五龙鹅 MHC classⅠ基因组基因的 PCR 扩增与鉴定. 24
2.2.2重组质粒的鉴定.......... 25
2.2.3重组质粒测序结果...... 25
2.2.4五龙鹅 MHC classⅠ基因组基因测序结果分析 ........ 25
2.3讨论..... 26
3利用 Real time-PCR 对鹅 MHC class I 基因的检测 ...... 29
3.1试验材料和方法........... 29
3.1.1试验材料......... 29
3.1.2 质粒和菌株........ 29
3.1.3 主要工具酶及试剂......... 29
主要仪器......... 31
试验方法......... 31
五龙鹅 MHC class I 基因逆转录....... 31
五龙鹅 MHC class I 基因片段的回收............ 32
重组质粒的构建.......... 32
Real tine-PCR 对表达量的检测.......... 32
3.2 试验结果分析.... 34
目的基因的 PCR 扩增检测 ..... 34
目的基因的标准曲线的制备... 35
目的基因的 Real tine-PCR....... 36
讨论..... 37
4 鹅 MHC class I 基因的分子特性的分析 39
4.1 材料与方法...... 39
4.1.1 试验序列........... 39
4.1.2序列的提交..... 39
4.1.3核酸序列的基本分析.. 40
鹅 MHC class I 蛋白质一级序列的基本分析 40
鹅 MHC class I 蛋白质二级结构和功能预测 40
鹅 MHC class I 蛋白质三级结构预测............ 42
同源性分析与系统发育分析... 42
试验结果与分析........... 43
核酸序列基本分析...... 43
蛋白质一级序列的基本分析... 44
4.2.3 鹅 MHC class I 蛋白二级结构和功能预测....... 45
鹅 MHC class I 蛋白三级结构和功能预测.... 49
同源性分析..... 50
讨论..... 51
论...... 53
参考文献...... 55
附录........ 60
致谢........ 71
攻读硕士论文期间发表的学术论文. 73
导师组意见.. 75
学位论文独创性声明............ 77
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