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硕士论文-利用精子载体法制备转基因小鼠疾病模型的初步研究，共60页，24633字
摘 要
精子介导基因转移是以精子为载体，在受精时将外源目的基因导入卵母细胞，是目
前转基因动物研究中简单而高效的方法学之一。本研究以 ICR 小白鼠为试验动物，用精
子载体法制备转基因小鼠模型，并根据得到的结果分析讨论精子载体法制备转基因动物
的可行性及优缺点。
本文进行了如下研究：
外源 DNA 转染小鼠精子的研究：利用 DIG 末端标记技术和免疫组化技术研究小
鼠精子转染外源 DNA 的效率。试验结果发现，不同小鼠个体精子转染阳性率有明显差
异，平均为 13%左右。小鼠精子具有自发结合外源 DNA 能力，结合部位集中在精子顶
体后躯，结合的外源 DNA 首先“挂”在精子膜表面，继而被内化转运到细胞内，但并非
所有的结合 DNA 都被内化。
精子介导法制备转基因小鼠的试验研究：利用考马斯亮蓝染色技术评价小鼠精子顶
体反应发生的情况，选择合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术，将体外转染 GFP
并获能的小鼠精子对成熟卵母细胞进行体外受精，受精卵进行体外培养，荧光显微镜下
观察胚胎，结果表达 GFP 的阳性率为 4.7%。试验结果证明了精子介导法制备转基因小
鼠的可行性。
乙肝病毒结合蛋白表达载体的构建：利用 PCR 和基因重组技术构建了 HBV 结合蛋
白表达载体，经过酶切鉴定和基因测序证实了载体序列的正确性，并作为外源 DNA 准
备用于转染小鼠精子制备动物疾病模型。
本研究初步建立了利用精子载体法制备转基因小鼠的平台，为今后制备动物疾病模
型奠定了基础。但没有进行 HBV 结合蛋白基因的转染，今后还需对本试验作进一步的
研究。
关键词：精子载体法；转基因动物；体外受精；基因重组
目 录
中文摘要...I
英文摘要...II
英文缩写词表.......... III
前 言.........
概 述.........
精子结合外源 DNA 及内化转运的分子机制.............
外源 DNA 在精子细胞内的存在与降解......
精子载体法制备转基因动物策略..
体外精子介导法 ........
3.1.1 精子与外源 DNA 的共孵育….
3.1.2 脂质体包裹 DNA 转染精子......
3.1.3 电穿孔法......
3.1.4 显微注射受精法（ICSI）.........
3.1.5 限制性内切酶介导法（REMI）
3.1.6 单克隆抗体 C 介导法
体内精子介导法 .........
4 结语 ...
试验内容...
1 外源 DNA 转染小鼠精子的研究.....
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物 ..
1.1.2 试验试剂 ..
1.1.3 试验仪器 ..
试验方法.. 10
1.2.1 外源 DNA pEGFP-N1 的准备 10
1.2.2 精子转染试验方法......... .......... 12
1.2.3 转染精子的免疫组化检查方法..... ….… 12
1.3结果.... 13
pEGFP-N1 质粒鉴定及纯化..... 13
1.3.2 转染精子的免疫组化检测........ 14
1.3.3 孵育时间及 DNA 浓度对精子转染的影响
讨论
小结
精子介导法制备转基因小鼠的试验研究..... 17
试验材料......... 17
2.1.1 药品试剂 .. 18
2.1.2 试验动物 .. 18
2.1.3 外源 DNA .. 18
2.1.4 试验主要仪器 ......... 18
2.2试验方法......... 18
2.2.1 卵母细胞的采集和体外受精
2.2.2 GFP 表达的检测 ......... 19
2.3结果......... 19
2.3.1 体外精子获能的评价
........ 19
2.3.2 体外受精及体外培养结果
2.3.3 早期胚胎中绿色荧光蛋白表达结果.............. 21
2.4讨论.......... 21
2.4.1 利用考马斯亮蓝染色技术评价体外受精液对精子获能的效果.... 21
2.4.2 体外受精及体外培养系统的建立..........
2.4.3 精子载体法转染 GFP 在早期胚胎中的表达......... 22
3小结.. 23
乙肝病毒结合蛋白表达载体的构建............. 24
3.1试验材料........24
3.1.1 试验试剂...... 24
3.1.2 试验仪器...... 24
3.2试验方法......... 25
3.2.1 真核表达载体 3’端 PolyA 的 PCR 扩增.. 25
3.2.2PCR 产物的回收.......
pMD18-TPolyA 连接及酶切鉴定............ 26
3.2.4 酶切质粒 pTieph及片断的回收 26
pTHBVbp 质粒的体外重组...... 27
pTHBVbp 质粒酶切鉴定 ........ 28
试验结果及分析 ......... 28
PolyA 的 PCR 扩增及 pMD18-TPolyA 质粒酶切、测序结果.............. 28
pTieph 质粒的酶切鉴定 ........ 31
3.3.3 体外重组质粒 pTHBVbp 的酶切鉴定及测序结果 ............. 32
讨论.. 33
小结.. 34
全文结论... 35
参考文献... 36
附录........... 40
致谢........... 45
个人简介... 46