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硕士论文-紫菜cSSR引物的开发、应用及AFLP分析，共84页，43618字
摘 要
紫菜作为大型经济海藻，由于其基因组较小，生长周期中具有单倍体和双倍体的世
代交替现象，是研究海藻遗传发育较好的模式植物。然而在开发利用紫菜资源的过程中，
种质问题长期以来一直是困扰其生产的严重问题。本研究用 SSR 和 AFLP 分子标记技术
对紫菜材料进行了分析。
本研究首次报道了紫菜 cSSR 引物的开发及其在种质鉴定中的应用。从已经公布的
20779 个紫菜 EST 序列中，共找出 SSRs (长度至少 20bp) 392 个，包含在 201 个 EST 序
列中，删除重复的序列，最终共得到 65 个 SSR-ESTs。根据 SSR 侧翼序列设计了 48 对
CSSR
引物，其中，41 对引物能在大多数材料中扩增出条带，用这些引物对 22 个紫菜材
料进行 SSR 分析。选用扩增条带清楚的 21 对引物共 94 个位点进行了聚类分析，从引物
PC01，PC11，PC12，PC28 扩增的条带中选择 12 条扩增和重复性较好的带，构建了这 22
个材料的指纹图谱。用所开发的 cSSR 引物在其他海藻中进行 PCR 扩增分析，结果显示，
没有一对引物能在所有选用的材料中扩增出相同的条带。
为验证 cSSR 分析的结果，随机选用 24 对引物组合对 27 个紫菜材料进行了 AFLP 分
析，选用扩增条带多而且清楚的 9 个引物组合共 511 个扩增位点进行聚类分析。从引物
组合 M-CGA/E-AA 和 M-CGA/E-TA 的扩增产物中选择 13 条带构建了 27 个紫菜的指纹图谱。
通过 AFLP 分析，共获得 21 个特异的 AFLP 标记，迄今对 8 条特异性条带进行了回收，
克隆和测序，其中 6 条测序成功，2 条 AFLP 标记顺利转成 SCAR 标记。
实验证明：SSR 和 AFLP 聚类结果基本一致。
cSSR 标记的开发、DNA 指纹图谱的构建及 SCAR 标记的转化为紫菜种质鉴定、分类
及产权保护提供了有效的方法。
关键词：紫菜，CSSR，AFLP，SCAR，聚类分析，指纹图谱
目 录
摘要ⅰ
Abstract ……………ⅱ
缩写词表……………ⅲ
前言1
1. 紫菜研究概况……1
2. 分子标记概述……3
2.1 遗传标记概述…3
2.1.1 形态标记……3
2.1.2 细胞学标记……3
2.1.3 生化标记……4
2.1.4 分子标记……4
2.2 分子标记的种类4
2.2.1 基于 DNA-DNA 杂交的 DNA 标记6
2.2.2 基于 PCR 的分子标记……………7
2.2.3 基于限制性酶切和 PCR 的分子标记11
2.2.4 基于单个核苷酸多态性的 DNA 分子标记……………14
2.3 分子标记的应用15
2.3.1 构建分子连锁图谱………………16
2.3.2 基因的分子标记与定位…………17
2.3.3 品种的纯度鉴定18
2.3.4 分子标记的辅助选择……………19
2.3.5 杂种优势预测…19
2.3.6 遗传多样性研究20
3. 研究的立题依据、路线及意义………21
3.1 研究的立题依据21
3.2 研究的技术路线23
3.3 研究的意义……24
研究内容……………26
1. 紫菜 cSSR 引物的开发及在种质鉴定中的应用………26
1.1 材料和方法…26
1.1.1 实验材料 26
1.1.2 DNA 的提取26
1.1.3 紫菜 EST 序列及 SSR-ESTs 的搜索…………28
1.1.4 引物设计……28
1.1.5 cSSR 分析……28
1.1.6 数据统计、聚类分析及指纹图谱的建立……………29
1.1.7 cSSR 引物在其它海藻中的扩增分析29
1.2 结果与分析……29
1.2.1 紫菜 EST 序列及 SSR-ESTs 的搜索………………29
1.2.2 引物设计与验证30
1.2.3 cSSR 分析……30
1.2.4 数据统计、聚类分析及指纹图谱的建立……………34
1.2.5 cSSR 引物在其它海藻中的扩增分析………………37
1.3 讨论…………37
2. 紫菜 AFLP 分析及指纹的建立……40
2.1 实验材料与方法40
2.1.1 实验材料……40
2.1.2 DNA 的提取…40
2.1.3 AFLP 分析……42
2.1.4 数据统计、聚类分析及指纹图谱的建立……………45
2.1.5 SCAR 标记的转化………………45
2.2 结果与分析 …45
2.2.1 DNA的酶切、连接………………45
2.2.2 预扩增………45
2.2.3 选择性扩增……46
2.2.4 条带的统计、聚类分析及指纹图谱的建立…………46
2.2.5 SCAR标记的转化………………49
2.3 讨论……………53
结论55
参考文献……………56
附录………………63
附录一………………63
附录二………………64
附录三………………65
硕士期间发表及完成的论文…………66
致谢………………67
导师组意见…………68
学位论文独创性声明及学位论文版权使用授权书…………69