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硕士论文-17β-雌二醇对寿光鸡原始生殖细胞发育的影响，共55页，33103字
摘 要
原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)作为生殖干细胞，是禽类地方稀有
品种遗传资源保存及通过转基因改良禽类品种的重要载体细胞。因此，PGCs 的体内外
发育研究，对建立禽类生殖腺嵌合体和转基因技术平台具有重要意义。17β-雌二醇（17
β-estradiol，17β-E2）作为一种雌性激素，对多种细胞体细胞和生殖细胞的增殖具
有重要促进作用。本研究以寿光鸡 28 期胚胎为试验材料，探讨了 17β- E2对体内外性
腺原始生殖细胞（Gonadal primordial germ cells，gPGCs）发育的影响。首先，制作
28 期鸡胚性腺组织切片，进行 PAS 和 HE 染色，并在显微镜下进行形态鉴定；其次，鸡
胚发育到第 X 期，用鸡蛋开窗法注入 17β- E2，封口孵化至 28 期，用 EDTA-胰酶解离
法消化性腺组织，分离获得 gPGCs，观察和分析 17β- E2对 gPGCs 体内发育的影响；第
三，孵化至 28 期胚胎（未经 17β- E2处理），分离性腺，将分离的 PGCs 和性腺基质细
胞共培养，根据差速贴壁原理分离纯化 PGCs，培养于添加不同浓度 17β- E2的培养液，
观察和分析 17β- E2对 gPGCs 体外发育的影响。试验结果如下：
1 PGCs 形态学研究
组织切片观察表明， gPGCs 呈圆形或卵圆形，有伪足，直径为 10μm-15μm，胞核
呈圆形或椭圆形，偏向细胞边缘，大小为 5μm-7.5μm。核内缘有少量异染色质，常染色
质均匀分布。分离后的细胞悬液涂片观察表明，游离的 gPGCs 呈圆形或卵圆形，有伪足，
周围有明显的光环，直径为 12.5μm-20μm。
2 17β- E2对 PGCs 体内发育的影响
17β- E2处理组鸡胚的 PGCs 数量（1601±126 个/枚）显著高于（P<0.05）注射乳
化剂对照组（1327.5±210.4 个/枚）和未注射乳化剂对照组（1401.80±312.5 个/枚）。
3 PGCs 的分离纯化
分离未经 17β- E2处理的 28 期寿光鸡胚胎性腺，经酶消化，总细胞数为（8.7±1.7）
×104个/枚，其中 gPGCs 数量为 1401.80±312.5 个/枚，占总细胞数的 1.61%。将分离
后的 gPGCs 与性腺基质细胞共培养，经 24h 培养差速贴壁分离，获得总细胞数为 1542
±589 个/枚，其中 gPGCs 为 432.5±106.5 个/枚，回收率为 36.52±4.86%，纯度为 28.1
±1.9%，存活率 71.7±2.2%。
4 17β- E2对体外培养寿光鸡原始生殖细胞的影响
将分离纯化的 PGCs 分别培养于添加不同浓度（0 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20ng/mL）
17β- E2的 TCM199 基础培养液中，培养 1～6 天。结果显示，5ng/mL 添加组与 0ng/mL
添加组比较，PGCs 的发育能力无显著差异，而 10ng/mL 和 20ng/mL 添加组与 0ng/mL 及
5ng/mL 添加组比较，PGCs 的发育能力差异显著（P<0.05）。但是，10ng/mL 和 20ng/mL
添加组之间比较，PGCs 的发育能力无显著差异。
上述结果表明，17β- E2对寿光鸡性腺原始生殖细胞体内外的发育都有明显的促进
作用，可应用于禽类 PGCs 体外培养体系。
关键词：寿光鸡胚胎 原始生殖细胞 分离 体外培养 17β-雌二醇
目 录
中文摘要 .............. 1
英文摘要 .............. 3
英文缩写词表 ...... 5
前言 ...... 1
1 文献综述 .......... 1
1.1 禽类胚胎早期发育 ..... 1
1.2 禽类原始生殖细胞的发生和迁移 ............. 2
1.3 禽类原始生殖细胞的应用 ......... 5
1.4 禽类原始生殖细胞体外培养的相关因素 . 7
1.5 禽类原始生殖细胞的形态研究 11
1.6 禽类原始生殖细胞培养的研究进展 ....... 12
1.7 雌激素及其作用 ....... 14
1.7.1 雌激素的种类 ........ 14
1.7.2 雌激素的作用机制 14
1.7.3 雌激素受体的研究 15
1.7.4 雌激素对鸡胚的影响 ............ 15
1.7.5
17β-雌二醇............. 16
2 试验材料与方法
2.1 材料与方法 ............. 18
2.1.1 种蛋的来源与孵化 18
2.1.2 试剂 ........ 18
2.1.3 PGC 的形态观察方法............ 18
2.1.4 17β-雌二醇对鸡胚的处理...... 19
2.1.5 鸡胚性腺的分离与消化 ........ 19
2.1.6 鸡胚 gPGC 的分离纯化........ 19
2.1.7 鸡胚 gPGCs 的培养 .............. 19
2.1.8 统计分析 20
3 试验结果与分析 .......... 21
4 讨论 .............. 26
结论 ............ 31
附录 ............ 32
参考文献 .......... 35
致谢 ............ 41