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资料简介
硕士论文-水貂犬瘟热竞争ELISA及免疫胶体金诊断技术的研究,共72页,40157字
摘要
本试验将纯化的犬瘟热病毒与弗氏佐剂等量混合乳化后,分别于家兔背部皮下及腿
部肌肉多点注射,免疫 4 次(每次间隔 2 周)后用纯病毒加强免疫制备了兔抗犬瘟热多
克隆抗体,多克隆抗体采用饱和硫酸铵分级沉淀法纯化,纯化后抗体用 SDS-PAGE 鉴定
提纯效果,间接 ELISA 法检测抗体纯化前后的效价,考马斯亮蓝法测定提纯后 IgG 含
量;以犬瘟热病毒为包被抗原,饱和硫酸铵纯化的多克隆抗体为竞争抗体建立了检测犬
瘟热抗体的竞争 ELISA 技术;利用柠檬酸三钠还原氯金酸制备了 40nm 胶体金颗粒标记
单克隆抗体 5B7,将单抗 5B7、羊抗鼠 IgG 分别包被于 NC 膜作为检测线(T 线)和对
照线(C 线),金标单抗 2D6 吸附于金标垫,组装试剂条,建立了检测犬瘟热病毒的胶
体金免疫层析诊断方法。
试验结果显示:多抗片段为一条轻链和一条重链,大小分别为 25KD 和 50KD;提
纯后抗体杂带较少;纯化前后抗体效价未发生改变,均为 1:102400;纯化后抗体含量为
4.1mg/ml。竞争 ELISA 体系包被抗原的最适包被浓度为 0.625μg/ml;最佳包被液为
0.05mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液;最佳包被条件为 37℃ 2 h 后 4℃过夜;兔抗犬瘟热 IgG
最佳稀释度为 1:1600;封闭液为 5%小牛血清,37℃温育 1h 为最佳封闭条件;血清与抗
原作用的最佳作用时间为 45min;HRP-羊抗兔 IgG 做 1:1000 倍稀释,37℃温育 1h 为最
佳酶标二抗作用条件;底物最佳反应条件为 37℃避光反应 15min;确定反应阴阳抑制率
限制为 30%;检测阴阳血清 ELISA 技术与琼脂扩散试验符合率达到 95.7%、97.8%;所
建立的 ELISA 检测技术与其他貂病没有交叉反应,表明建立的 ELISA 诊断技术具有良
好的特异性。胶体金与单抗标记的最佳 pH 为 8.2;胶体金最适稳定量为 30μg/ml;金标
抗体的最佳稀释倍数为 1:2;配方 C 稀释金标抗体后溶液颜色不变,背景浅,金标抗体
释放较完全;利用组装的试纸条检测样品,阳性结果为试纸条上的 T 线与 C 线均呈红色,
阴性结果仅 C 线呈红色;试纸条最低检测限为 9ng/ml;试剂条在 4℃保存期为 6 个月;
试剂条检测细小病毒、传染性肝炎阳性样品,结果均为阴性,证明建立的胶体金免疫层
析诊断技术具有良好的特异性和重复性。
关键词:水貂;犬瘟热;多克隆抗体;竞争 ELISA;胶体金免疫层析技术
目录
中文摘要 ⅰ
英文摘要 ⅱ
缩略词表 ⅳ
前言 .......... 1
文献综述 .. 2
1 生物学特性.......... 2
2 流行病学.............. 2
3 犬瘟热实验室诊断............. 3
4 免疫胶体金快速检测技术的研究进展........... 7
试验一 兔抗犬瘟热多克隆抗体的制备与提纯11
1 材料..... 11
1.1 试验动物.......... 11
1.2 抗原... 11
1.3 主要试剂.......... 11
1.4 主要仪器.......... 11
1.5 溶液配制.......... 11
2 方法..... 12
2.1 免疫程序操作.. 12
2.2 多克隆抗体效价测定.... 13
2.3 多克隆抗体的提纯......... 13
2.4 IgG 含量的测定 ............. 14
2.5 IgG 纯度的测定 ............. 14
3 结果..... 15
3.1 多克隆抗体效价的测定 15
3.2 多克隆抗体的纯化........ 15
3.3 IgG 含量的测定 ............. 16
4 讨论..... 16
4.1 免疫血清的制备............ 16
4.2 多克隆抗体的纯化........ 17
5 小结..... 18
试验二 犬瘟热竞争 ELISA 检测技术的研究. 19
1 材料..... 19
1.1 抗原.. 19
1.2 血清.. 19
1.3 主要仪器设备.. 19
1.4 溶液的配制...... 19
2 ELISA 方法的建立 ........... 20
2.1 酶标板均一性的测定.... 20
2.2 包被抗原及兔抗 CDVIgG 的最佳 ELISA 反应浓度的测定 .. 20
2.3 竞争 ELISA 反应条件的筛选 ..... 20
2.4 竞争 ELISA 方法的反应程序 ..... 23
2.5 重复性试验..... 23
2.6 特异性试验..... 23
2.7 临床样品的检测............ 23
3 结果..... 23
3.1 酶标板均一性的测定.... 23
3.2 抗原最佳包被浓度及抗体稀释倍数的确定 ............. 24
3.3 竞争 ELISA 试验条件的确定 ..... 25
3.4 竞争 ELISA 阴阳性抑制率的确定 ............ 32
3.5 重复性试验..... 36
3.6 特异性试验..... 36
3.7 临床样品的检测............ 37
4 讨论..... 37
4.1 竞争 ELISA 检测抗体方法的建立 ............ 37
4.2 阴阳性值判定标准的确定........... 38
4.3 临床样品的检测............ 38
5 小结..... 39
试验三 水貂犬瘟热病毒免疫胶体金快速检测技术的研究......... 40
1 材料..... 40
1.1 主要试剂......... 40
1.2 主要仪器及耗材............ 40
1.3 溶液的配制..... 40
2 方法..... 41
2.1 胶体金的制备及鉴定.... 41
2.2 金标抗体的制备............ 41
2.3 免疫胶体金试纸条的制备........... 43
2.4 免疫胶体金层析法最佳条件的选择 .......... 44
2.5 试纸条性能的测定........ 45
3 结果..... 45
3.1 胶体金的制备. 45
3.2 金标抗体的制备............ 46
3.3 试剂条的组装及结果判定........... 46
3.4 免疫胶体金层析法最佳条件的选择 .......... 47
3.5 试剂条性能的测定........ 49
4 讨论..... 50
4.1 胶体金颗粒的制备........ 50
4.2 胶体金最佳 pH 的确定 . 51
4.3 胶体金标记蛋白最佳浓度的确定.............. 51
4.4 金标抗体的制备............ 51
4.5 金标耗材的选择............ 52
4.6 试纸条的组装及保存.... 52
4.7 假阳性的原因分析........ 52
5 小结..... 52
结论 54
参考文献 55
致谢 .. 59
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