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硕士论文-狂犬病病毒糖蛋白在CAV-2 IX蛋白的展示及特性研究，共93页，82242字
摘要
狂犬病是重要的人兽共患传染病，引起中枢神经系统的感染，病死率几乎 100%。我
国是狂犬病的多发区，近年来，我国人狂犬病病例攀居世界第二。家养犬是我国狂犬病
的重要传播宿主，85%～95%的人狂犬病病例是由犬咬伤所导致，50%～70%的狂犬病病例
发生在农村。由于缺少安全有效、价格低廉、使用方便的动物狂犬病疫苗，加之群众意
识淡薄，导致我国家犬的免疫覆盖率极低，野生动物更无狂犬病的计划免疫。
犬及犬鼬科野生动物是狂犬病病毒侵入人群的主要传播媒介。因此研制安全有效的
动物用狂犬病疫苗，是预防人狂犬病的关键。本实验室在前期的工作中，建立了以犬 2
型腺病毒（CAV-2）弱毒株为载体表达狂犬病病毒弱毒株 SRV9 糖蛋白的重组 CAV-2 疫苗
（CAV-2-CGS），免疫试验结果表明，该重组疫苗可诱发机体产生较高水平的针对狂犬病
病毒的免疫力。但是与完整狂犬病病毒免疫相比，仍然有较大的提高空间。重组疫苗免
疫中和抗体产生水平不高，影响因素可能有保护性抗原基因的选择、外源基因的表达水
平、体内初始腺病毒抗体的干扰等。因此为了进一步提高该重组病毒的免疫效价，本研
究作为整个课题的一部分，选择狂犬病强毒 8202 株的糖蛋白膜外区作为保护性抗原，
以犬 2 型腺病毒 pIX 为展示表达载体，构建重组犬 2 型腺病毒。同时对 8202 株糖蛋白
膜外区重组病毒进行犬免疫试验，检测重组病毒免疫原性，制备狂犬病重组活载体疫苗
候选株，为狂犬病重组活载体疫苗研究奠定基础。同时探讨 CAV-2 pIX 表达外源基因的
调控，为完善该病毒载体，提供理论依据。
研究首先在前期获得的CAV-2感染性全基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2的基础上，对其
pIX进行改造，构建了改进的CAV-2载体pPolyⅡ-CAV-2-pIX-RVG；扩大了该载体插入外
源基因的容量，完善了CAV-2载体展示研究。然后对CAV-2 pIX的羧基末端插入带有
pEGFP-C1 polyA的狂犬病病毒8202株糖蛋白膜外区基因，转染犬肾细胞系（MDCK），成
功获得了重组病毒CAV-2-pIX-RVG。
对重组病毒 CAV-2-pIX-RVG 进行了生物学特性及 pIX 表达调控研究。通过电镜观察、
细胞半数感染量（TCID50）测定、血凝和血凝抑制试验，检测病毒的形态、反应原性、
生长特性。通过 PCR、RT-PCR、Western blot 方法对重组病毒的遗传稳定性和糖蛋白膜
外区基因的转录和表达量进行了检测，探讨 CAV-2 pIX 的外源基因的插其 pIX 表达调控
的影响。同时为比较两株重组病毒的免疫原性之间的差别，对该重组病毒与前期实验室
构建的CAV-2-CGS，进行免疫实验研究。结果显示，该株重组病毒具有典型的腺病毒形
态结构；相同TCID50的重组病毒和疫苗株病毒都能凝集人的红细胞，血凝效价没有差别；
相同TCID50重组病毒和疫苗株病毒接种MDCK细胞，病毒增殖特性与疫苗株病毒没有差异；
重组病毒在体外连续传代，性质稳定，没有出现外源基因的缺失和重排；重组病毒感染
细胞后能够稳定转录和表达狂犬病病毒糖蛋白，具有良好的反应原性；pIX对外源基因
的表达量无影响。
对表达狂犬病强毒株 8202 株糖蛋白膜外区的重组病毒 CAV-2-pIX-RVG，通过口服和
肌肉注射两种免疫途径对犬进行免疫试验。免疫时每条犬口服 2mL（108 TCID50/0.1mL）
病毒，免疫前及免疫后每周采血。经 Western-blot 分析抗体组成；HI 检测腺病毒抗体
血凝抑制效价；荧光抗体病毒中和试验（FAVN）测定抗体中和效价。结果显示，重组病
毒在犬体内同时诱导产生了针对狂犬病病毒和腺病毒的两种特异性抗体。HI 试验表明，
该株重组毒与疫苗株病毒血凝效价消长规律基本一致。犬首次免疫后产生的抗狂犬病病
毒中和抗体效价为 2.47 IU±0.35IU，抗体的消长规律相同。重组病毒 CAV-2-pIX-RVG
可以在犬体内产生具有保护水平的中和抗体(0.5 个国际单位以上)。
综上所述，本研究成功构建了可以表达 8202 株糖蛋白膜外区的 CAV-2 pIX 展示载
体 pPolyⅡ-CAV-2-pIX-RVG；构建了表达狂犬病病毒强毒株 8202 株糖蛋白膜外区的重组
犬 2 型腺病毒 CAV-2-pIX-RVG。证明 CAV-2 pIX 对病毒的生物学特性无影响，对外源基
因表达量无影响；表达狂犬病病毒强毒株 8202 株糖蛋白膜外区的重组病毒疫苗
CAV-2-pIX-RVG，可以刺激机体产生具有保护水平的中和抗体，免疫效果与前期
CAV-2-CGS 重组毒差异不显著，可以作为狂犬病重组疫苗候选株。
关键词：犬 2 型腺病毒；IX 蛋白；狂犬病病毒；糖蛋白；重组病毒
目 录
中文摘要 ····· I
英文摘要 ·· III
英文缩写词表 ·········· VI
引言 ········ 1
第一篇 文献综述 ······ 2
第一章 腺病毒及腺病毒载体的研究进展 ·············· 2
1 腺病毒 ···· 2
1.1 分
类 · 2
1.2 形态学及理化特性 ············· 3
1.3 腺病毒衣壳组成 · 3
1.4 基因组结构 ········· 4
1.5 蛋白及其功能 ····· 5
1.6 病毒复制 ············· 8
1.7 致病性 · 9
1.8 肿瘤原性 ············· 9
2 腺病毒载体 ············ 9
2.1 腺病毒载体的发展现状 ····· 9
2.2 腺病毒载体的分类 ··········· 12
2.3 腺病毒载体的特点 ··········· 13
2.4 腺病毒载体的应用 ··········· 13
第二章 狂犬病新型疫苗的研究进展 ···· 16
1 狂犬病病毒的分子生物学特性 ·········· 16
2 狂犬病新型疫苗 ·· 17
2.1 亚单位疫苗 ······· 18
2.2 合成肽疫苗 ········ 20
2.3 DNA 疫苗 ·········· 20
2.4 抗独特型抗体疫苗 ··········· 22
2.5 基因重组狂犬病毒减毒疫苗 ············ 22
2.6 重组活载体疫苗 23
2.7 转基因植物口服疫苗 ······· 25
第二篇 研究内容 ···· 26
试验一 犬 2 型腺病毒 IX 蛋白载体及狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组病毒的构建 ·········· 26
1 材
料 ·· 26
1.1 细胞、菌株及病毒 ··········· 26
1.2 质粒 ··············· 26
1.3 主要试剂 ············ 26
2 方法 ·· 27
2.1 病毒培养及总 RNA 提取· 27
2.2 狂犬病病毒 8202 株糖蛋白基因 RT-PCR 扩增 ·············· 27
2.3 基因操作的常规实验方法 ··············· 28
2.4 犬 2 型腺病毒 IX 蛋白载体的构建 · 32
2.5 狂犬病 8202 株糖蛋白膜外区重组 CAV-2 的构建········· 32
2.6 MDCK 细胞培养及传代 ··· 32
2.7 感染性重组 CAV-2 基因组转染 MDCK 细胞 32
2.8 腺病毒全基因组的提取及纯化 ······· 35
2.9 重组病毒基因组的酶切及 PCR 鉴定·············· 35
3 结果 ·· 35
3.1 狂犬病毒 8202 株糖蛋白膜外区的克隆及序列分析结果·············· 35
3.2 8202,CVS 与 SRV9 株糖蛋白的同源性及疏水性及抗原表位优势分析 ········ 38
3.3 犬 2 型腺病 IX 蛋白载体 pEGFP-SIX 的酶切鉴定········ 38
3.4 重组质粒 pPoly-Ⅱ-CAV-2-pIX-RVG 的酶切鉴定········· 39
3.5 表达狂犬病病毒 8202 株糖蛋白膜外区的重组 CAV-2 的包装及鉴定········· 40
4 讨
论 ·· 41
4.1 犬腺病毒载体改造位置的选择 ······· 41
4.2 犬腺病毒载体的外源基因容量 ······· 42
4.3 腺病毒载体的构建策略 ··· 42
4.4 狂犬病病毒毒株及抗原基因的选择 ··············· 42
4.5 重组病毒的包装 ··············· 43
5 小结 ·· 44
试验二 重组犬 2 型腺病毒 IX 蛋白的表达调控研究 ·········· 45
1 材料 ·· 45
1.1 病毒和细胞 ······· 45
1.2 主要试剂 ··········· 45
2 方法 ·· 45
2.1 重组病毒的形态学观察 ··· 45
2.2 RT-PCR 检测重组病毒外源基因的 mRNA 转录 ············ 45
2.3 重组病毒外源蛋白表达量 ELISA 检测 ·········· 46
2.4 重组病毒外源蛋白表达水平的 Western 印迹分析 ········· 46
2.5 重组病毒感染力的滴定(TCID50 的测定) ······ 47
2.6 重组病毒的生长增殖特性比较 ········ 48
2.7 重组病毒的血凝性试验 ··· 48
2.8 连续传代重组病毒的遗传稳定性检测 ··········· 48
3 结果 ·· 48
3.1 重组病毒的形态观察 ······· 48
3.2 RT-PCR 检测重组病毒外源基因的 mRNA 转录结果 ···· 49
3.3 重组病毒外源蛋白表达水平的 ELISA 检测 ·· 49
3.4 重组病毒外源蛋白表达水平的 Western 印迹分析 ········ 50
3.5 重组病毒感染力的滴定(TCID50 的测定) ······ 50
3.6 重组病毒的生长增殖特性比较 ······· 50
3.7 重组病毒的血凝性及血凝抑制性 ··· 51
3.8 连续传代病毒的遗传稳定性 ············ 52
4 讨论 ·· 52
5 小结 ·· 53
试验三 狂犬病病毒 8202 株糖蛋白膜外区重组犬 2 型腺病毒的免疫研究······· 54
1 材料 ··· 54
1.1 病毒及细胞 ········ 54
1.2 试验动物 ············ 54
1.3 主要试剂及仪器 54
2 方法 ··· 54
2.1.实验动物分组、免疫与采血 ············ 54
2.2.特异性抗体的检测 ············ 54
2.3 采用血凝抑制试验（HI）试验测定血清的血凝抑制效价··········· 55
2.4 荧光抗体中和试验（FAVN） ········· 56
3 结果 ·· 56
3.1.血清中抗体 Western blot 分析 ······· 56
3.2 HI 试验测定犬腺病毒的血凝抑制效价 ··········· 57
3.3 FAVN 方法测定血清中和抗体的效价 ············· 58
4 讨
论 ·· 58
4.1 免疫途径 ··········· 58
4.2 中和抗体检测方法 ··········· 60
4.3 疫苗效果评价 ··· 61
5 小结 ·· 61
结论 ·· 63
参考文献 ·· 64
附录 ·· 71
致谢 ·· 72