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资料简介

硕士论文-水杨酸诱导黄瓜幼苗抗冷性的基因表达,共55页,29153字
摘要
水杨酸(Salicylic acid,SA)是植物体内的一种简单的酚类物质,作为内源信号分
子,在植物许多生理过程中起着非常重要的作用。SA 能提高植物对生物胁迫和非生物
胁迫的抗性,如微生物胁迫、温度胁迫、渗透胁迫等。黄瓜(Cucumis sativus)属于葫
芦科甜瓜属一年生草本植物,起源于亚热带,是典型的冷敏型植物。黄瓜所有组织以及
果实都是对低温敏感的,通常 10~12℃即不能正常生长,低于 5℃就会难以生存。通过
对 SA 诱导的黄瓜冷胁迫相关基因的分离及其性质的研究,构建抗冷性转基因黄瓜品种,
可解决园艺生产中黄瓜易受冷害的问题,同时可探讨植物抗冷的机理和 SA 诱导植物抗
逆性的分子机理。本实验主要通过 mRNA 差异显示技术和反向 Northern 杂交筛选 SA 诱
导的黄瓜冷胁迫相关基因,并对这些基因的性质进行初步探讨和研究。
以黄瓜幼苗为试验材料,8±1℃冷胁迫下分别用 SA (3mmol/L, pH6.0) 溶液和蒸馏水
喷施黄瓜 (“新优 30”) 幼苗,以处理后 48h 的叶片总 RNA 为模板反转录 cDNA,利用
mRNA 差异显示技术和反向 Northern 杂交筛选冷胁迫下 SA 诱导的黄瓜幼苗 cDNA,主
要研究结果如下:
1 mRNA 差异显示技术分离回收 12 个 cDNA 序列,经反向 Norhtern 杂交验证其
中 3 个为 SA 显著诱导但不是 SA 依赖表达的 cDNA 片段,分别命名为 SICCL_1,SICCL_2
和 SICCL_3,Genbank 登陆号分别为 FG120885 ,FG120886 和 FG120887。cDNA 片段
连接到 pGM-T 质粒载体,转化大肠杆菌 DH5α 菌株,经酶鉴定,测序。测序结果显示:
SICCL_1,SICCL_2 和 SICCL_3 长度为 178bp,201bp 和 241bp,约 100~500bp。
2 Blastn 同源性检索结果表明:SICCL_1 与黄瓜花叶病毒 (Cucumber Mosaic Virus,
CMV) 诱导的甜瓜叶片基因 AM734282.2 高度同源;SICCL_2 与 5 个基因 cDNA 片段高
度同源(EL890967.1, EH050706.1, CD715793.1, CB345776.1 和 BO157769.1),它们分别来
自五种胁迫对应的五种植物;未发现与 SICCL_3 同源的序列,可能为新的基因。由此
推测,SA 可能诱导植物基因表达产生交叉保护反应而对各种生物和非生物胁迫产生广
谱抗性。我们将通过 RACE 或构建 cDNA 文库等方法获得这些基因全长 cDNA,并对这
些基因的功能作进一步研究。
关键词:黄瓜(Cucumis sativus),水杨酸,冷胁迫,mRNA 差异显示,反向 Northern
杂交
目录
中文摘要Ⅰ
英文摘要Ⅱ
缩略词....Ⅳ
文献综述
前言..........1
1 植物冷害与抗冷机理的研究进展 ....1
1.1 植物对冷害的反应 ..........1
1.2 植物抗冷机理的研究进展 .............2
1.2.1 抗冷相关基因与植物抗冷性 ......2
1.2.2 细胞膜系统与植物抗冷性 ..........3
1.2.3 细胞抗氧化能力与植物耐冷性 ..3
1.2.4 细胞内物质与植物耐冷性 ..........4
2 水杨酸诱导植物抗冷性的研究进展 5
2.1 SA 对低温胁迫植物生理生化的影响 ..........5
2.2 SA 对冷胁迫植物基因表达的影响 ..............5
3 mRNA 差异显示的原理及其在植物抗冷性研究中的应用.........6
3.1 mRNA 差异显示的原理 .6
3.2 mRNA 差异显示植物抗冷性中的应用 .......7
4 研究的目的与意义 ............7
研究内容
1 试验材料..............8
1.1 植物材料...........8
1.2 主要化学试剂 ...8
1.3 工具酶、引物等 ..............8
1.4 试剂盒9
1.5 主要仪器设备 ...9
1.6 菌株及克隆载体 ..............9
1.7 溶液的配制 .....10
2 试验方法............12
2.1 总 RNA 的提取 .............12
2.2 总 RNA 的鉴定 ............12
2.2.1 总 RNA 纯度与浓度检测 .........12
2.2.2 总 RNA 完整性检测 ..12
2.2.3 总 RNA 保温试验 ......12
2.3.总 RNA 的 DNaseI 处理 .............13
2.4 cDNA 第一链合成 ........13
2.5 RT-PCR 扩增 ..14
2.5.1 PCR 扩增体系 ............14
2.5.2 PCR 扩增参数 ............14
2.6 DDRT-PCR 产物的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 .......14
2.6.1 电泳程序......14
2.6.2 银染程序......15
2.7 cDNA 差异片段的回收及二次扩增...........15
2.8 反向 Northern 杂交 .......15
2.8.1 差异筛选探针的标记 15
2.8.2 探针标记效率检测 .....16
2.8.3 PCR 扩增产物的变性 17
2.8.4 点膜.............17
2.8.5 预杂交和杂交 ............17
2.8.6 洗膜.............18
2.8.7 显色与检测 .18
2.9 目标 cDNA 片段转化测序..........18
2.9.1 目标 cDNA 片段的回收 ...........18
2.9.2 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的制备 ......19
2.9.3 目标 cDNA 片段的连接 ...........19
2.9.4 目标 cDNA 片段转化 20
2.9.5 阳性重组质粒的筛选 .20
2.9.6 阳性重组质粒的酶切鉴定 ........20
2.10 EST 同源性对比..........21
3 结果与分析........21
3.1 总 RNA 质量检测及定量 ............21
3.1.1 植物材料总 RNA 浓度及纯度检测.........21
3.1.2 总 RNA 完整性分析 ..22
3.1.3 总 RNA 保温试验 ......22
3.1.4 DNaseⅠ消化总 RNA 的完整性检测......23
3.2 DDRT-PCR 产物的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 .......24
3.3 回收差异片段的二次扩增 ..........24
3.4 反向 Northern 杂交 .....25
3.4.1 探针标记效率的检测 25
3.4.2 杂交..............25
3.5 转化酶切检验 26
3.6 序列测定结果 27
3.7 EST 同源性对比............28
4 讨论.....28
4.1 黄瓜幼苗的处理 ............28
4.2 黄瓜叶片总 RNA 的提取 ............29
4.2.1 总 RNA 提取 ..............29
4.2.2 总 RNA 质量的检测 .29
4.3 mRNA 差异显示技术 ...30
4.3.1 单链 cDNA 的合成 ....30
4.3.2 引物和扩增参数的改进 ...........31
4.4 反向 Northern 杂交和假阳性......32
4.5 SA 诱导的胁迫相关基因的特异性与广谱性 ...........33
结论35
参考文献36
附录40
致谢41

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