学海网

硕士论文-枯草芽孢杆菌B44、B4菌株的培养条件及B44所产生抗真菌蛋白的研究，共57页，31614字
摘 要
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B44、B4 菌株是从小麦根际土壤中分离得到的。经测
定，两种枯草芽孢杆菌对棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌和小麦全蚀病菌 4
种植物病原真菌有较强的抑制作用[1]。为了进一步研究两种生防菌株的有效成份，本文通
过研究确定了枯草芽孢杆菌（B. subtilis）B44、B4 两种菌株的最佳发酵培养条件和确认了
发酵粗提液对 24 种植物病原真菌的抑制作用；并从 B44 菌株发酵液中分离得到了抗菌蛋
白，研究了其性质，对今后纯化该物质和应用研究打下了良好的基础。
采用不同的培养基、不同 PH 值、不同的温度、不同的通氧量、不同的发酵时间对 B44、
B4 两种菌株进行发酵培养，检测其发酵液的抑菌活性，得到了两种菌株产生抗菌蛋白的最
佳条件：（1）B44 菌株：在 pH 值为 7 的 Wakimoto’s 培养基中，以 30℃的温度、装液量为
90ml，摇床转速为 200r/min 震荡培养 24h 可得到大量的抗菌蛋白；（2）B4 菌株：在 pH 值
为 8 的 Wakimoto’s 培养基中，以 30℃的温度、装液量为 70ml，摇床转速为 200r/min 震荡
培养 48h 可得到大量的抗菌蛋白。
采用上述的培养条件，用环柱测定法测定了 B44 和 B4 菌株产生的抗菌蛋白粗提液对
小麦全蚀病菌和苹果轮纹病菌等 24 种植物病原真菌的抑制作用，检测结果显示，枯草芽孢
杆菌 B44 菌株产生的抗菌蛋白的抑菌效果要比 B4 菌株产生的好，故在以后的试验过程中
主要以 B44 产生的抗菌蛋白为主要研究对象。将 B44 菌株进行盆栽抑菌试验，抑菌结果较
好，抑菌效果达 50%以上。
枯草芽孢杆菌（B.subtilis）B44 菌株发酵培养产生的代谢产物，经 80%饱和硫酸铵沉
淀，茚三酮检测，显色为淡紫色，初步确认所产生的抗菌蛋白含有多肽或蛋白质或氨基酸。
产生的沉淀经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 3 种有机溶剂进行液液分配萃取后，发现抑菌
物质主要存留在水层，对水层物质进行透析、脱盐。将粗提物进行 ODS-C18 反相硅胶柱层
析，分别用 30%、50%、80%的甲醇水溶液做梯度洗脱。活性成分富集在 80%的甲醇洗脱
液中，浓缩后通过 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以明显地看出含有抗菌活性的蛋白条
带，分子量约为 10.53-20.10KDa，将所得抗性物质进行抑菌试验，抑菌效果较好。对所得
抗菌蛋白进行酸碱稳定性检测、溶解度、pH 值及氯仿的敏感性测定。
关键词：枯草芽孢杆菌 B44、B4 菌株；发酵条件；抑菌效果；抗菌蛋白
目录
摘要 .................I
Abstract ...........I
前言 ................ 1
文献综述 ........ 2
1 枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质..... 2
1.1 核糖体合成途径产生的抗菌物质................. 3
1.2 非核糖体合成途径产生的抗菌物质............. 4
2.枯草芽胞杆菌在植病生防中的作用机制及应用.............. 5
2.1 枯草芽胞杆菌在植病生防中的作用机制..... 5
2.2 枯草芽孢杆菌在植病生防中的应用............. 8
3 枯草芽胞杆菌培养优化条件.......... 9
4 蛋白质层析介质的发展概况........ 10
4.1 离子交换层析介质... 11
4.2 疏水作用层析介质... 12
4.3 层析技术的应用....... 12
材料与方法 .. 14
1 试验材料... 14
1.1 供试生防菌株........ 14
1.2 供试植物病原真菌 14
1.3 仪器与试剂............... 15
1.3.1 仪器..... 15
1.3.2 供试试剂................ 15
1.3.3 培养基. 16
2 研究方法... 16
2.1 拮抗活性测定方法及指示菌的确定........... 16
2.2 枯草芽孢杆菌 B44 和 B4 菌株发酵培养基的优化 .... 16
2.2.1 枯草芽孢杆菌 B44 和 B4 菌株种子发酵液的准备 .. 16
2.2.2 枯草芽孢杆菌 B44 和 B4 菌株最佳发酵培养基的选择 ............ 17
2.3 B44 和 B4 菌株产生抗菌蛋白培养条件的优化 .......... 17
2.4 生防菌株产生的抗菌蛋白粗提液对 24 种植物病原真菌的抑制作用.......... 17
2.4.1 B44 和 B4 菌株产生的抗菌蛋白粗提液的制备 ....... 17
2.4.2 生防菌株产生的抗菌蛋白粗提液对 24 种植物病原真菌的抑制作用....... 18
2.5 B44 菌株对小麦全蚀病菌的盆栽抑菌试验 ................. 18
2.5.1 病原菌孢子悬浮液制备.......... 18
2.5.2 土壤的处理............ 18
2.5.3 小麦的处理与播种 18
2.5.4 病情指数及防治效果计算公式............... 19
2.5.5 小麦的田间管理... 19
2.6 B44 菌株所产生抗菌蛋白的提取 ............... 20
2.6.1 抗菌蛋白的确定... 20
2.6.2 有机溶剂萃取....... 20
2.6.3 透析，脱盐........... 20
2.6.4 柱层析.. 20
2.7 抗菌蛋白的主要性质测定......... 21
2.7.1 抗菌蛋白分子量的测定.......... 21
2.7.2 抗菌蛋白在水、有机溶剂中的溶解性测定.............. 21
2.7.3 抗菌蛋白对氯仿的稳定性检测................ 21
2.7.4 抗菌蛋白对酸碱的稳定性检测................ 21
结果与分析 .. 22
1 枯草芽孢杆菌 B44 和 B4 菌株发酵培养基的优化 ........ 22
1.1 拮抗活性测定方法及指示菌的确定........... 22
1.2 枯草芽孢杆菌 B44 和 B4 菌株在不同培养基上的发酵粗提液对两种植物病原菌的抑制作用...... 23
2 B44 和 B4 菌株产生抗菌蛋白培养条件的优化 ............. 25
2.1 B44 菌株产生抗菌蛋白培养条件的优化 ... 25
2.2 B4 菌株产生抗菌蛋白培养条件的优化 ..... 26
3 生防菌株产生的抗菌蛋白粗提液对 24 种植物病原真菌的抑制作用............. 28
3.1 B44 菌株产生抗菌蛋白粗提液对 24 种植物病原菌的抑菌试验 . 28
3.2 B4 菌株产生抗菌蛋白粗提液对 24 种植物病原菌的抑菌试验 ... 29
4 B44 菌株对小麦全蚀病菌的盆栽抑菌试验结果 ............ 30
4.1 枯草芽孢杆菌 B44 菌液浸种法对小麦全蚀病的防治效果 .......... 30
4.2 生防菌土壤浇灌法对小麦全蚀病的防治效果............. 31
5 B44 菌株所产生抗菌蛋白的研究结果 .......... 31
5.1 抗菌蛋白的确定...... 31
5.2 有机溶剂萃取结果... 32
5.3 透析，脱盐.............. 32
5.4 反相硅胶 ODS-C18 柱层析结果 32
6 抗菌蛋白的主要性质测定结果.... 34
6.1 抗菌蛋白分子量的测定............. 34
6.2 抗菌蛋白在水、有机溶剂中的溶解性测定................. 34
6.3 抗菌蛋白对氯仿的稳定性检测. 35
6.4 抗菌蛋白对酸碱的稳定性检测. 35
结论 .............. 36
讨论 .............. 37
参考文献 ...... 39
附录 .............. 43
致谢及其他... 45