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硕士论文-成年小鼠睾丸和附睾中蛋白磷酸酶1活性检测及其调控，共47页，25474字
摘 要
精子的成熟过程受细胞内蛋白质磷酸化的调控，而蛋白质磷酸化受蛋白激酶(英文
全称，PK)和蛋白磷酸酶(英文全称，PP)的双重调控。有关蛋白激酶活性调控对小鼠精
子成熟的影响已有许多研究报道，但是蛋白磷酸酶活性及其调控对小鼠精子成熟的研究
尚未多见。本研究的目的旨在证明小鼠精子中蛋白磷酸酶的存在及其活性的调控对小鼠
精子的影响。本研究用 6～8 周龄昆明雄性小鼠为试验材料，用 PNPP 试剂盒及分光光度
法，进行了如下研究。
1. 睾丸提取液及精液的容积对蛋白磷酸酶活性的影响
将睾丸（140±10mg/mL）和精子(5～7×106 个/mL)用超声破碎仪破碎，提取上清液，
分别抽取不同容积的提取液，用于蛋白磷酸酶活性分析。结果显示，小鼠睾丸中存在较
高的蛋白磷酸酶活性，随着提取液容积的增加，蛋白磷酸酶的活性显著（P﹤0.01）升
高。小鼠附睾精子中蛋白磷酸酶的活性较低，但随着精子提取液量的增加，蛋白磷酸酶
活性显著（P﹤0.01）升高。根据提取液容积依赖性的酶活性曲线图，将用于酶活性反
应的睾丸提取液的量为 5 μl，精子提取液的量为为 20μl。
2. 睾丸组织提取液与底物的反应时间对蛋白磷酸酶活性的影响
将睾丸提取液与底物反应的时间设定为 0min、10min、15min、30min、1h、1.5h、
2h、2.5h、3h，观察反应时间依赖性的酶活性曲线。结果显示，在与底物反应半小时开
始，酶活性曲线直线上升，反应两小时候以后酶活性曲线基本达到平衡。因此，酶与底
物作用时间区域在 0.5～2.0 h 之内。对于酶活性较高的提取物可设反应时间为 30 分钟，
酶活性较低的提取物可增加反应时间至 1.0 h。
3. 睾丸和附睾组织中蛋白磷酸酶活性的比较
用相同重量（140±10mg/mL）的睾丸、附睾头部和附睾尾部的提取液进行酶活性测
定。结果显示，睾丸组织蛋白磷酸酶活性最高，其次是附睾头部，附睾尾部最低，三者
之间差异极显著（P﹤0.01）。
4. 睾丸和附睾精子蛋白磷酸酶活性检测
睾丸精子用 Percoll 梯度浓度分离法分离，附睾精子用浮游方法分离。分离后分别
调节浓度，经破碎分离上清液，测定蛋白磷酸酶活性。结果显示，睾丸精子蛋白磷酸酶
活性最高，其次是附睾头部精子，附睾尾部精子最低，三者之间差异显著（P﹤0.01）。
5．睾丸精子蛋白磷酸酶 1 和蛋白磷酸酶 2A 活性检测
花萼海绵诱癌素 A(calyculin A, CA)和冈田酸（Okadaic acid, OA）是蛋白磷酸酶
1（protein phosphatase 1, PP1）和蛋白磷酸酶 2A(protein phosphatase 2A, PP2A)
的特异性抑制剂， PP1 和 PP2A 对 CA 同样敏感，而 PP2A 对 OA 的敏感性比 PP1 高 100
倍，因此根据不同浓度 CA 和 OA 对精子提取液的抑制能力，可以检测精子提取液中 PP1
或 PP2A 的含量。分离睾丸精子，经破碎添加 CA 和 OA，检测蛋白磷酸酶活性。结果显示，
当 CA 的浓度增加至 1.0 nmol/mL 时,能够强烈抑制（84%）蛋白磷酸酶活性，继续增加
CA 的浓度并没有显著提高抑制效果；当 OA 的浓度增加 1.0 nmol/mL,时几乎不抑制蛋白
磷酸酶活性，继续增加 OA 的量,能够逐渐可抑制蛋白磷酸酶活性，当 OA 浓度达到 1000
nmol/mL 时,能够强烈抑制蛋白磷酸酶活性（88%）。
6. 附睾精子蛋白磷酸酶 1 和蛋白磷酸酶 2A 活性检测
分离附睾头部和尾部精子，分别添加 1.0 nmol/mL CA 和 OA，检测蛋白磷酸酶活性
结果显示，与未添加对照组比较，无论是附睾头部还是尾部精子，CA 添加组都能够显著
（P﹤0.01）抑制蛋白磷酸酶活性（80%），可是 OA 添加组仅有微弱的抑制效果。
7．CA 和 OA 对小鼠附睾精子运动能力的调控
用浮游法分离附睾头部和尾部精子，调节浓度为 5～7×106 个/mL，添加 1.0 nmol /mL
CA 或 1000 nmol/mL OA，在 CO2 培养箱中孵育 10 分钟（37℃，5% CO2），显微镜下观测
精子运动能力。结果显示，无论是 CA 还是 OA 都能显著（P﹤0.01）提高附睾头部和尾
部精子的运动能力。
上述研究结果表明，小鼠睾丸和附睾精子中存在明显的蛋白磷酸酶活性。特异抑制
剂抑制试验证明，酶活性类型主要为蛋白磷酸酶 1，这些酶活性随精子的成熟过程递减，
通过特异抑制剂调控精子蛋白磷酸酶活性，能够显著提高附睾精子的运动能力，说明蛋
白磷酸酶 1 对精子的功能获得具有重要的调控作用。
关键词
蛋白磷酸酶 1，蛋白磷酸酶 1cγ，PNPP, 冈田酸，花萼海绵诱癌素 A, 蛋白磷
酸酶 1γ2
目 录
中文摘要……………1
英文摘要……………3
缩略词及符号含义…6
文献综述……………7
1.前言………………7
2.国内外研究进展…8
2.1 蛋白激酶的研究进展…………………… 8
2.1.1 蛋白激酶的分类……………………… 8
2.1.2 蛋白激酶的结构和功能……………… 8
2.2 蛋白磷酸酶的研究进展………………… 9
2.2.1 蛋白磷酸酶的分类与理化特征……… 9
2.2.2 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶 1 的结构和功能………………… .9
2.3 雄性生殖系统蛋白磷酸酶的研究进展 13
2.3.1 精子中蛋白磷酸酶的发现历程………13
2.3.2 蛋白磷酸酶 1 在精子中的功能………13
2.3.3 精子特异性蛋白磷酸酶-PP1γ2…….14
实验部分………… 16
3.材料与方法…… 16
3.1 试验动物………16
3.2 试剂……………16
3.3 取材…………. 16
3.3.1 睾丸、附睾取材………………………16
3.3.2 附睾精子取材16
3.3.3 睾丸精子取材16
3.4 酶活性测定….17
3.4.1 蛋白磷酸酶活性的检测………………17
3.4.2 蛋白磷酸酶 1 和 2A 的检测……………17
3.5 统计学方法….18
4.试验设计及结果.19
4.1. 睾丸提取液及精液的容积对蛋白磷酸酶活性的影响…………19
4.2 睾丸组织提取液与底物的反应时间对蛋白磷酸酶活性的影响 20
4.3 睾丸和附睾组织中蛋白磷酸酶活性变化曲线图……………….21
4.4 睾丸和附睾精子蛋白磷酸酶活性检测…22
4.5 睾丸精子蛋白磷酸酶 1 和 2A 活性检测24
4.6 附睾精子蛋白磷酸酶 1 和 2A 活性检测19
4.7 OA、CA对附睾精子运动力的调控………27
5.讨论…………… 29
6. 结论……………32
参考文献………….33
附录……………… 37