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硕士论文-同工酶技术和ISSR标记在灰树花菌株上应用的研究，共108页，46700字
摘要
对灰树花菌株的酯酶同工酶、多酚氧化酶同工酶、过氧化物酶同工酶、淀粉酶同工酶、
蛋白、SDS 变性蛋白的标记方法进行了研究，筛选出酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶两种
标记方法较适合灰树花的遗传分析。
研究了培养基类型、培养天数、培养温度、培养基初始 pH 值、培养基中碳源、培养
基中氮源、培养基中无机离子这些培养灰树花菌丝的环境条件和营养条件对酯酶同工酶和
过氧化物酶同工酶条带产生的影响，并以正交设计研究了培养基营养组合的影响。最终表
明，在 25℃下，以 PDA 综合培养基（马铃薯 20%；葡萄糖 2%；磷酸二氢钾 0.25%；硫酸镁
0.15%；蛋白胨 0.5%；琼脂 2%；维生素 B1 微量；pH 自然），平板培养 15 天，可获得带型
最丰富、染色最清晰的酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶。
对栽培灰树花子实体不同时期和不同组织部位的酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶进
行了研究。泰安灰树花成菇的酯酶同工酶带型最丰富，菇蕾的过氧化物酶同工酶带型最丰
富。三个栽培品种子实体都以菌盖边缘的酯酶和过氧化物酶的带型最为丰富。
对所有菌株的提取酶液进行酯酶和过氧化物酶的电泳检测共获得 51 条酶带，酯酶酶
带 44 条，Rf 值（迁移率）在 0.055—0.92 之间，过氧化物酶酶带 7 条，迁移率在 0.034
—0.46 之间；通过 NTSYSpc2.0 软件遗传分析表明，两两菌株间相似系数在 0.5882-1.0000
之间；聚类分析显示，在相似系数为 0.84 的水平上，可以将 68 个菌株划分为 11 个类群。
以所有菌株为研究材料，用 ISSR 引物 AC06、GT07、CA06 分别对所有菌株进行了 PCR
扩增，获得 80 条清晰的 DNA 条带，片段大小在 0.25—4.5Kb 之间；遗传分析表明，两两
菌株间相似系数在 0.3750-1.0000 之间；聚类分析显示，在相似系数为 0.80 的水平上，
可以将 68 个菌株划分为 11 个类群。
探讨并展望了同工酶技术在灰树花及食用菌领域的应用，提出了与以往遗传分析不同
的数据统计方法。
关键词：灰树花；同工酶；ISSR；rDNA；遗传分析
目录
摘要..... 1
ABSTRACT... 2
第一章 前
言........... 3
1.灰树花的研究进展.. 3
2.同工酶标记的研究概况...... 5
3.分子标记技术.......... 7
4.立题依据及目的意义........ 10
第二章 材料与方法. 13
1.同工酶标记 13
1.1 试验方法体系优化..... 13
1.1.1 标记方法的筛选.. 13
1.1.2 培养条件对同工酶标记的影响.. 17
1.1.3 正交设计最适营养组合.. 21
1.1.4 栽培生产中同工酶分析.. 22
1.2 同工酶标记的遗传多样性分析......... 22
1.2.1 供试材料.. 22
1.2.2 试验方法.. 25
1.2.3 数据分析.. 25
2.ISSR 标记.. 25
2.1 供试材料......... 25
2.2 试验方法......... 25
2.2.1 实验材料准备...... 25
2.2.2DNA 提取 . 25
2.2.3ISSR 分析. 27
2.2.4 扩增产物检测...... 28
2.2.5 ISSR 引物筛选.... 28
2.3 数据处理分析. 29
3.基于 ITS 片段的序列分析 ........... 29
3.1 试验材料......... 29
3.2DNA 提取 ........ 29
3.3 主要试剂......... 29
3.4 扩增反应......... 30
3.5PCR 产物检测 30
3.6 测序..... 30
第三章 结果与分析. 31
1.同工酶标记 31
1.1 试验方法体系优化..... 31
1.1.1 标记方法的筛选.. 31
1.1.1.1 酯酶同工酶检测........... 31
1.1.1.2 多酚氧化酶同工酶检测........... 31
1.1.1.3 过氧化物酶同工酶....... 32
1.1.1.4 淀粉酶同工酶检测....... 32
1.1.1.5 蛋白检测........... 33
1.1.2 培养条件对同工酶标记的影响.. 34
1.1.2.1 培养基类型筛选........... 34
1.1.2.2 培养天数的影响........... 35
1.1.2.3 培养温度的影响........... 37
1.1.2.4 培养基初始 pH 值的影响 ....... 38
1.1.2.5 培养基中碳源的影响... 39
1.1.2.6 培养基中氮源的影响... 41
1.1.2.7 培养基中无机离子的影响....... 42
1.1.3 正交设计最适营养组合.. 43
1.1.4 栽培子实体同工酶分析.. 44
1.1.4.1 不同时期的同工酶分析........... 44
1.1.4.2 子实体不同部位的同工酶分析........... 44
1.2 同工酶标记的遗传分析......... 45
2.ISSR 标记.. 49
2.1 DNA 的提取 ... 49
2.2 ISSR 引物的筛选 ....... 50
2.3 ISSR 遗传分析 ........... 52
3. 基于 ITS 片段的序列分析 ......... 54
3.1 扩增结果......... 54
3.2 序列分析......... 55
第四章 结论与讨论. 57
参考文献....... 63
附录... 67
附表一 同工酶分析菌株间相似系数表..... 67
附表二 ISSR 分析菌株间相似系数表....... 77
附图一 部分同工酶电泳图片......... 86
附图二 ISSR 电泳结检测图片....... 90
附图三 11 个菌株 ITS 片段序列 ... 94
致谢... 99