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硕士论文-聚肌胞合成条件的优化及其抗病毒作用的研究，共88页，45536字
摘 要
聚肌胞（polyinosinic-polycytidylic acid, polyI:C）是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基
互补配对形成的双链 RNA，是一种高效干扰素诱导剂。本研究利用国产原料首先对聚肌
胞的合成条件进行了优化，探讨了影响聚肌胞结构稳定性的因素。为探讨聚肌胞对特异
性免疫的影响，本文研究了新城疫免疫前后不同时间应用聚肌胞对雏鸡抗体水平的影
响。为探讨聚肌胞在鱼类中的抗病毒作用，研究了聚肌胞对患有淋巴囊肿病毒病牙鲆的
初步疗效；探讨了聚肌胞的抗病毒机制，实验进一步对聚肌胞不同用药途径诱导大菱鲆
抗病毒蛋白 Mx 转录水平的时相变化以及血液天然免疫相关指标的变化进行了较深入的
研究。研究结果如下：
1. 聚肌苷酸与聚胞苷酸合成聚肌胞的最适条件为：磷酸缓冲液（pH7.2）或 Tris-HCl
缓冲液(pH7.2)可以提供聚肌胞稳定的 pH 环境，聚肌苷酸和聚胞苷酸在 45℃条件下退
火，并在 100℃煮沸灭菌 30min 后采取水流迅速降温复性形成的聚肌胞减色效应显著，
适当增加金属离子（Na+，Ca2+）溶液的浓度可以增强聚肌胞结构的稳定性。聚肌苷酸
受 Na+的影响显著并且可以被溴化乙啶染色，表明聚肌苷酸溶液具有自身可以配对形成
双链的结构特点；聚胞苷酸不具备双链结构的特点；Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Na+在
一定浓度范围内可以明显提高聚肌胞双链的结合紧密度，而 Cu2+对聚肌胞双链结构具有
破坏作用；硫酸卡那霉素和钙离子可以保护聚肌胞抵抗 RNA 酶迅速降解的作用；实验发
现了不同动物的血清中 RNA 酶活性对聚肌胞的降解作用有差异,其中，鸡血清对聚肌胞
的降解最明显，而兔血清对聚肌胞降解不明显；聚肌胞的琼脂糖凝胶电泳发现，聚肌胞
的迁移率与 100bp 的 Marker 基本一致，Ca2+和硫酸卡那霉素对聚肌胞的电泳迁移率没有
影响。聚肌胞的性质及其稳定性的研究为开发价廉有效的新型抗病毒药物提供了工艺参
数基础。
2. 聚肌胞联合新城疫疫苗可以提高雏鸡血清中的免疫抗体滴度。免疫之前 48h、24h
和 12h 注射 polyI:C，雏鸡血液中抗体效价仅在 10 日龄明显升高；免疫新城疫疫苗的同
时及免疫之后 12h、24h 注射 polyI:C，9～12 日龄雏鸡血清抗体滴度均明显提高。PolyI:C
可以提高雏鸡免疫抗体滴度，对由弱毒苗刺激的免疫反应具有调理作用。实验结果为干
扰素诱导剂与弱毒疫苗的联合应用提供了重要的试验参考。
3. 本研究利用聚肌胞对患有淋巴囊肿病毒病的牙鲆进行了初步治疗，发现聚肌胞能
够抑制淋巴囊肿病毒复制。聚肌胞对轻度患病牙鲆治疗的 10 日内发现，仅 1 尾牙鲆死
亡，其中 10 尾鱼的较大肿瘤有明显脱落现象；而对患病较重的牙鲆治疗后发现，囊肿
脱落效果不明显，但囊肿也不增多，死亡率为 16%左右，对照组死亡率达到 40%。对患
有淋巴囊肿病毒病的牙鲆组织器官的石蜡切片显示，囊肿块内具有明显的肥大细胞；在
肉瘤根部的上皮组织内发现了许多比正常上皮细胞大数十倍的肥大细胞；鳃丝部位有明
显颗粒状聚集体，疑似病毒包涵体聚集体。本实验首次使用聚聚肌胞在水产养殖上进行
临床应用，并取得了一定的治疗效果，这将为困扰了水产业多年的病毒病的治疗提供依
据。
4 聚肌胞腹腔注射，浸泡和投喂等三种用药方式对大菱鲆血清中的碱性磷酸酶、酸
性磷酸酶活性有一定的影响，对血清溶菌酶活性的影响不显著，注射聚肌胞后大菱鲆血
液细胞中的白细胞比例有升高趋势，但与用药前相比差异不显著。在分子水平上，本试
验利用软件对大菱鲆 Mx 基因进行了分析，利用 Mx 基因保守区自行设计的引物扩增片
段特异性较高，初步建立了半定量 RT-PCR 法检测 Mx 基因的表达；三种用药途径诱导
Mx 转录水平的时相变化发现，三种途径均能高效诱导 Mx 蛋白 mRNA 的转录，一般在
48h 之后达到转录高峰，而且浸泡的方式更容易诱导 Mx 基因转录，在 120h 时仍然显著
高于对照，而注射和投喂途径在 96h 有下降趋势。实验首次从 Mx 基因转录水平上检测
聚肌胞诱导干扰素的效果，这不仅提供了检测 Mx 基因转录时相变化的方法，更为鱼类
干扰素系统提供了理论上的补充，具有重要理论和实际意义。
关键词：聚肌胞；Mx 蛋白；转录水平；新城疫抗体；淋巴囊肿病；血液指标
目录
摘 要....... i
ABSTRACT....... iii
英文缩写词表....... vi
文献综述.... 1
1综述前言. 1
2聚肌胞的发现、合成及其作用机理... 1
3聚肌胞在动物中的应用研究进展..... 3
4鱼类非特异性免疫体系..... 6
第一章 聚肌胞合成条件的优化及其性质的研究.. 12
1试验材料和方法.. 12
1.1 主要试剂 ...... 12
1.2 主要实验仪器 .. 12
1.3 所用溶液及其配制 ...... 13
1.4pH、温度和金属离子对聚肌胞的影响 ..... 14
1.5 钙离子和硫酸卡那霉素对聚肌胞的保护实验 14
1.6 聚肌胞分子量初步确定 .. 15
1.7 聚肌胞在不同动物血清中的降解 .. 15
2结果与分析...... 16
2.1 聚肌苷酸、聚胞苷酸和聚肌胞的一般性质 .. 16
2.2 pH 对聚肌胞的影响...... 19
2.3 温度对聚肌胞合成条件的影响 .... 20
2.4 金属离子对聚肌胞配对条件的影响 21
2.5 钙离子和卡那霉素对聚肌胞的保护作用 .... 22
2.6 聚肌胞分子量的初步探讨 24
2.7 聚肌胞在血清中的降解 .. 25
3讨论.... 27
第二章 聚肌胞对雏鸡新城疫免疫抗体水平的影响 31
1实验材料和方法.. 31
1.1 实验材料 ...... 31
1.2 实验仪器 ...... 31
1.3 实验设计 ...... 31
1.4 抗体效价测定 .. 32
2结果分析 33
2.1 疫苗免疫之前注射 polyI:C 的影响 33
2.2 免疫的同时以及免疫后应用 polyI:C 的影响 34
3讨论.... 35
第三章 聚肌胞对牙鲆淋巴囊肿病毒病的初步治疗 36
1试验材料和方法.. 36
1.1试验动物 ...... 36
1.2 实验设计 ...... 36
1.3 淋巴囊肿病毒病组织切片 37
2结果与分析...... 38
2.1 组织病理观察 .. 38
2.2 聚肌胞对淋巴囊肿病毒病的初步治疗效果 .. 39
3讨论.... 40
第四章 聚肌胞诱导大菱鲆 Mx 基因的转录及对相关免疫因子的影响. 42
1试验材料和方法.. 42
1.1 实验材料和主要试剂 .... 42
1.2 主要仪器 ...... 43
1.3实验设计 ...... 43
1.4 非特异性免疫因子的测定 43
1.5 血涂片的制作 .. 44
1.6 半定量 RT-PCR 方法的初步建立 ... 46
2试验结果分析.... 48
2.1 聚肌胞对血液中非特异免疫因子的影响 .... 48
2.2 半定量 RT-PCR 法检测 Mx 基因的转录 ...... 55
讨论.... 58
结论... 61
参考文献... 62
附件... 67
致谢... 73
作者简介... 74