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  • 资源类别:论文
  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:生物化学与分子生物学
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资料简介
硕士论文-中度嗜盐菌产酯酶菌株的筛选鉴定、产酶条件及酶学性质研究,共66页,31411字
摘 要
本论文对从黄海海岸盐场分离筛选的两株高产酯酶中度嗜盐菌菌株进行了形态学
特征、生理生化特性研究以及基于16S rRNA序列的分子生物学分析,并对菌株产酯酶条
件及部分酶学性质进行了研究。
1.中度嗜盐菌高产酯酶菌株的筛选
将取自青岛市城阳区上马镇东风盐场的土样、泥样及水样进行富集培养分离,经嗜
盐菌培养基培养获得 155 株嗜盐菌,然后对分离纯化的细菌在添加 Tween 80 的 DSMZ
755 培养基上培养,通过是否产生透明圈或晕圈的现象筛选出产脂酶的菌株 73 株。根据
透明圈或晕圈的大小与菌株直径之比,筛选到 10 株高效降解 Tween 80 的菌株。后经摇
瓶复筛,测定发酵液中酶活力大小,得到两株高产酯酶的中度嗜盐菌菌株 DF-I11 和
DF-B6。对菌株经发酵培养后的上清液及破碎菌体进行非变性凝胶电泳,后经 RR 固蓝
特异染色,菌株 DF-I11 破碎菌体与菌株 DF-B6 上清液所产脂酶都表现为酯酶性质,而
有所区别的是前者产胞内酶,而后者产胞外酶。
2.胞内酯酶产生菌株 DF-I11 的鉴定、产酶条件及酶学性质
菌株 DF-I11 形态学鉴定为革兰氏阳性,菌体短杆状,长 1.5-4.0μm,直径 0.8-1.0μm,
菌株生长的最适条件分别为 37℃,NaCl 10%,pH 8.5;生理生化分析显示,菌株能够利
用 D-果糖、D-半乳糖、麦芽糖、蔗糖、D-葡萄糖作为唯一碳源,氧化酶、接触酶及脂
酶阳性。经 16S rRNA 序列分析,菌株 DF-I11 与 Halobacillus 菌属的同源性高于 97%,
与 H.locisalis 具有 99.7%的相似性。单因素设计分析最佳产酶条件表明,菌株 DF-I11 最
适生长条件下,总酶活达到最高的时间为 48h,其它最适产酶条件分别为 NaCl 浓度
10%(w/v)、pH 值 9.0、装样量 70ml/250ml。部分酶学特性研究显示,菌株 DF-I11 酯酶
反应的最适条件为 pH 8.5,温度 60℃;金属离子 Mg2+、Ca2+、Mn2+能够增强酶活反应,
而 Zn2+、Cu2+、Fe3+等抑制酶活;酯酶以对硝基苯酚辛酸酯为底物时相对酶活最高,其
次为乙酸酯、丁酸酯,几乎不降解大于十个碳链的羧酸酯。
3.胞外酯酶产生菌株 DF-B6 的鉴定、产酶条件及酶学性质
形态学观察表明,菌株 DF-B6 革兰氏染色阴性,菌体弧状,大小 0.7-1.8μm,两端
有鞭毛;生理生化试验结果表明菌株能够在 4-40℃生长,菌株生长的最适 NaCl 浓度为
5%-10%,最适 pH 为 8.0;能够利用蔗糖、D-果糖、D-半乳糖、D-山梨醇作为唯一碳源;
氧化酶、接触酶及脂酶阳性。菌株经 16S rRNA 序列及系统发育树分析,菌株 DF-B6 为
Idiomarina 属,定名为 Idiomarina sp.strain DF-B6;单因素试验分析最佳产酶条件表明,
菌株 DF-B6 在最适生长条件下总酶活达到最大的时间为 36 h,产酶的最适条件分别为
NaCl 浓度 5%,温度 37℃, pH 8.0,转速 150 rpm,装样量 100ml/250ml(v/v)。部分酶学特
性研究显示,在含 8%NaCl 的 0.05 M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中,50℃条件下作用,酶活
性最高;当反应液中金属离子浓度为 10 mM 时,Mg2+、Ca2+和 Mn2+对酶活有激活作用,
而 Zn2+、Fe3+和 Cu2+则对酶反应有抑制作用;底物特异性实验表明,酶对碳原子数目<
10 的对硝基苯酯类底物反应特异性相对较高,而对碳原子数目>10 的底物反应特异性
很低,其中硝基苯棕榈酸酯和橄榄油的酶活力几乎为零,确定 DF-B6 菌株分泌的脂裂解
酶为酯酶,而非脂肪酶。
关键词:酯酶;中度嗜盐菌;非变性凝胶电泳;16S rRNA;系统发育树。
目录
中文摘要........ Ⅰ
英文摘要........ Ⅲ
缩略词表........ Ⅴ
第一章 文献综述......... 1
1.1 酶的研究... 1
1.1.1 酯酶与脂肪酶..... 1
1.1.2 微生物脂酶的基础研究.. 1
1.1.3 微生物脂酶的应用研究.. 4
1.2 中度嗜盐菌的研究 5
1.2.1 极端环境微生物. 5
1.2.2 嗜盐菌的分类..... 5
1.2.3 中度嗜盐菌的相溶性物质........... 7
1.2.4 中度嗜盐菌的应用研究.. 7
1.3 立题依据... 8
1.3.1 酯酶是重要的工业用酶.. 8
1.3.2 研究中度嗜盐菌酯酶的意义....... 9
1.4 研究内容. 10
1.4.1 酯酶产生菌株的筛选.... 10
1.4.2 酯酶产生菌株的鉴定.... 10
1.4.3 酯酶产生菌株发酵条件的研究. 10
1.4.4 酯酶酶学性质研究........ 10
第二章 中度嗜盐菌高产酯酶菌株的筛选...... 11
2.1 试验材料. 11
2.1.1 主要仪器........... 11
2.1.2 主要试剂........... 11
2.1.3 材料...... 11
2.1.4 分离培养基....... 11
2.1.5 初筛培养基....... 12
2.1.6 复筛培养基....... 12
2.2 方法......... 12
2.2.1 样品的富集分离............ 12
2.2.2 嗜盐菌菌株的分离纯化 12
2.2.3 菌种的保藏....... 12
2.2.4 酯酶产生菌株的初筛.... 12
2.2.5 酯酶产生菌株的复筛.... 13
2.2.6 酶活的测定....... 13
2.2.7 对硝基苯酚标准曲线.... 13
2.2.8 非变性凝胶电泳............ 14
2.3 结果与分析.......... 14
2.3.1 嗜盐菌菌株的分离........ 14
2.3.2 中度嗜盐菌酯酶产生菌株的初筛.......... 14
2.3.3 中度嗜盐菌酯酶产生菌株的复筛.......... 14
2.3.4 酯酶显色反应... 15
2.4讨论与结论........ 15
第三章 胞内酯酶产生菌株 DF-I11 的鉴定、产酶条件及酶学性质... 17
3.1 试验材料.. 17
3.1.1 主要仪器........... 17
3.1.2 主要试剂........... 17
3.1.3 菌株...... 17
3.1.4 培养基.. 17
3.2 试验方法. 17
3.2.1 形态学观察....... 17
3.2.2 生理生化性质鉴定........ 17
3.2.3 分子生物学鉴定............ 17
3.2.4 酶活的测定....... 18
3.2.5 产酶条件研究... 18
3.2.6 部分酶学性质研究........ 18
3.3 结果与分析.......... 18
3.3.1 菌株 DF-I11 的形态学特征 ....... 18
3.3.2 菌株 DF-I11 的生理生化特性 ... 18
3.3.3 菌株的分子生物学鉴定 19
3.4 菌株 DF-I11 产酶条件...... 20
3.4.1 菌株 DF-I11 的生长与酯酶产量 ............ 20
3.4.2 NaCl 浓度影响菌株 DF-I11 酯酶产量.... 20
3.4.3 温度影响菌株 DF-I11 酯酶产量 ............ 21
3.4.4 pH 影响菌株 DF-I11 酯酶产量 .. 21
3.4.5 装样量影响菌株 DF-I11 酯酶产量 ........ 21
3.5 部分酶学性质...... 22
3.5.1 酶活的最适温度、pH ... 22
3.5.2 金属离子对酶活的影响 23
3.5.3 酶的底物特异性............ 23
3.6 讨论及结论........... 24
第四章 胞外酯酶产生菌株 DF-B6 的鉴定、产酶条件及酶学性质 ... 25
4.1 试验材料. 25
4.1.1 主要仪器........... 25
4.1.2 主要试剂........... 25
4.1.3 菌株...... 25
4.1.4 培养基.. 25
4.2 试验方法. 25
4.2.1 形态学观察....... 25
4.2.2 生理生化性质鉴定........ 25
4.2.3 分子生物学鉴定............ 25
4.2.4 酶活的测定....... 26
4.2.5 酯酶发酵条件研究........ 26
4.2.6 部分酶学性质研究........ 26
4.3 结果与分析.......... 26
4.3.1 菌株 DF-B6 的形态学特征........ 26
4.3.2 菌株 DF-B6 的生理生化特性.... 26
4.3.3 菌株的分子生物学鉴定 26
4.4 菌株 DF-B6 酯酶发酵条件 ........... 27
4.4.1 菌株 DF-B6 的生长与酯酶........ 27
4.4.2 NaCl 浓度影响菌株 DF-B6 酯酶产量 .... 27
4.4.3 温度影响菌株 DF-B6 酯酶产量 28
4.4.4 pH 影响菌株 DF-B6 酯酶产量... 28
4.4.5 装样量影响菌株 DF-B6 酯酶产量......... 29
4.4.6 转速影响菌株 DF-B6 酯酶产量 29
4.4.7 不同碳源影响菌株 DF-B6 酯酶产量..... 30
4.5 部分酶学性质...... 31
4.5.1 酶活的最适温度、pH ... 31
4.5.2 酶活的稳定性... 33
4.5.3 金属离子对酶活的影响 34
4.5.4 酶的底物特异性............ 34
4.6 讨论及结论.......... 35
4.6.1 中度嗜盐菌高产酯酶菌株......... 35
4.6.2 酯酶发酵条件... 35
4.6.3 酯酶特性........... 35
4.6.4 应用前景........... 36
参考文献........ 37
附录Ⅰ............ 41
附录Ⅱ............ 44
附录Ⅲ ........... 46
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