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硕士论文-预热诱导HSP70表达对小鼠胚胎热损伤的保护作用，共56页，32185字
摘 要
选择昆明白雌性小鼠作为试验动物，以 37℃ 2 h 条件下正常体外培养为对
照，将体外培养至扩张囊胚（hCG 后 113 h）的小鼠胚胎分别施以 38℃ 2 h、39℃ 2 h
和 40℃ 2 h 的预热应激处理，然后分别将预热胚胎和对照组胚胎置于 42℃高温
下处理 3 h，以观察热休克蛋白 70（HSP70）表达对高温所致胚胎损伤的影响。
用 Western blot 技术检测小鼠囊胚内 HSP70 的表达；台盼兰染色后体视显微镜观
察热应激后囊胚的死亡与畸形，计算存活率。以研究小鼠囊胚的热敏性、热应激
对小鼠囊胚 HSP70 表达的影响以及囊胚热耐受的获得与 HSP70 表达之间的关
系，判断 HSP70 增量表达对胚胎抵抗高温损伤有无保护作用。试验结果如下：
1.热应激对囊胚存活率的影响
38℃ 2 h、39℃ 2 h 和 40℃ 2 h 不同温度热应激处理各组囊胚存活率（分别
为 83.01%、69.11%和 63.51%）均低于对照组（94.01%）。 39℃ 2 h 和 40℃2h 与
对照组相比差异极显著 (P<0.01) ，38℃ 2 h 与对照组之间差异显著 (P<0.05) ；
囊胚存活率在 39℃ 2 h 和 40℃ 2 h 组间无显著差异（P>0.05）。
2.诱导热应激对囊胚存活率的影响
在不同温度诱导热应激组中，先经 38℃ 2 h、39℃ 2 h 和 40℃ 2 h 预热应激
处理，再经 42℃高温处理 3 h 后囊胚的存活率（25.16%、36.37%和 22.81%）均
高于直接 42℃3 h 热应激组（13.07%）。其中 39℃热诱导 2 h 囊胚存活率为最高
（36.37%），与直接 42℃3 h 热应激处理组（13.07%）相比差异显著（P<0.05）。
在 39℃不同时间诱导热应激组中，先经 39℃3 h 热诱导，再经 42℃ 3 h 热应激后
囊胚的存活率（38.81%）极 显 著 (P<0.01)高于对照组（ 15.15%）。39℃ 1 h 和 39℃ 2 h
热诱导组存活率（ 32.81%和 34.92%）显 著 (P<0.05)高于对照组（15.15%），但 39℃ 1
h 和 39℃ 2 h 热诱导组之间差异不显著(P>0.05)。
3.不同温度预热应激对囊胚 HSP70 表达的影响
经 Western blot 检 测 ，38℃ 2 h、39℃ 2 h 和 40℃ 2 h 预热应激组内囊胚 HSP70
表达量较 37℃对照组均增加。39℃热应激处理 2 h 囊胚 HSP70 表达量（0.839）
极显著（P<0.01）高于对照组（0.781）； 38℃热应激处理 2 h 和 40℃热应激处理
2 h 囊胚 HSP70 表达量（0.806 和 0.810）也显著（P<0.05）高于对照组（0.781）。
4.不同时间预热应激对囊胚 HSP70 表达的影响
选 39℃作为最佳诱导温度，对胚胎进行不同时间预热应激处理。Western blot
检测可见 39℃ 1 h、39℃ 2 h 和 39℃ 3 h 的预热应激处理组均有 HSP70 的 表 达
其中 39℃热应激 3 h 表达量最高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，39℃ 1 h
和 39℃ 2 h 组也显著(P<0.05)高于对照组。
关键词：小鼠；囊胚；热应激；胚胎存活率；HSP70
目 录
中文摘要……....……….....1
英文摘要……..….…………….……….3
缩略词对照…..….…………….……….5
文献综述.1
1 前言...1
1.1 热应激处理诱导保护作用的研究情况…………...1
1.1.1 热应激处理诱导热耐受力的获得1
1.1.2 热应激处理后产生保护作用的机制…………...2
1.1.3 热应激预处理的应用……………4
1.2 热应激与热休克蛋白 70………….5
1.2.1 热应激与热休克反应…………...5
1.2.2 热休克蛋白的分类……………...5
1.2.3 热休克蛋白 70 的分类………….6
1.2.4 热休克蛋白 70 的生物学特性.…6
1.2.5 热休克蛋白 70 表达的基因调控…………….…7
1.3 HSP70 的生物学功能……………8
1.3.1 分子伴侣作用……8
1.3.2 提高胚胎的热耐力9
1.3.3 抗细胞凋亡作用…9
1.3.4 抗氧化作用………10
1.3.5 免疫保护作用……10
1.4 热休克蛋白 70 与早期胚胎发育.....11
1.4.1 体内发育胚胎中热休克蛋白 70 的表达….…….11
1.4.2 体外培养胚胎中热休克蛋白 70 的表达……......11
1.4 小结及展望………...12
2 材料与方法…….……..13
2.1 试验材料….……….13
2.1.1 试验动物………...13
2.1.2 试剂……………...13
2.1.3 仪器设备………….……….……..13
2.2 试验方法……….….14
2.2.1 试验方案的总体设计.…………..14
2.2.1.1 胚胎发育时期的确定…………….…………….……...….......14
2.2.1.2 胚胎分组与体外热应激处理……….……...…14
2.2.1.3 不同时间的热应激处理…….…14
2.2.2 小鼠超排处理………….………..14
2.2.3 CZB 培养液的配制……….……….…....………..15
2.2.4 胚胎采集……...….15
2.2.5 胚胎体外培养及质量鉴定……………..….….....15
2.2.6 电泳…………..…..15
2.2.6.1 蛋白质样品制备………..……...15
2.2.6.2 SDS-PAGE 凝胶电泳……..…………….……...15
2.2.6.3 凝胶非铵盐银染法.…….……...15
2.2.7 Western blot………….……….………….……..…17
3 结果………….………..19
3.1 热应激囊胚及染色后的形态…………….………….………….....19
3.2 热应激对囊胚存活率的影响………….……….….20
3.3 不同温度热诱导小鼠囊胚 Western blot 检测结果.20
3.4 39℃不同时间热诱导对高温应激囊胚存活率的影响…………....21
3.5 39℃不同时间热诱导小鼠囊胚 Western blot 检测结果……….…..………….…..22
4 讨论….……. .……….24
4.1 热应激对囊胚存活率的影响.………24
4.2 诱导热应激对囊胚存活率的影响….27
4.3 诱导热应激对囊胚热休克蛋白 70 表达的影响………….………..27
4.4 HSP70 对胚胎的保护作用…….……28
结论….……………..28
致谢..29
参考文献....30
附录…………….....….36
攻读硕士学位期间发表的学术论文…41