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硕士论文-胸腺素αl基因的表达及产物纯化和活性检测的初步研究
摘 要
本试验旨在研究胸腺素 αl 的表达和活性检测，探索出基因工程生产胸腺素 αl
的途径和方法。试验根据大肠杆菌密码子偏爱性设计 Tαl 基因，由生物公司合成
并连接到 pMD18-T 载体上。pMD18-T 载体经 BamH I and HindⅢ双酶切回收的胸
腺素 αl 插入到同样双酶切回收的 pET-32a，转化大肠杆菌 DH5α。连接质粒测序
正确后，转化大肠杆菌 BL21（DE3），重组菌经氨苄青霉素筛选，IPTG 诱导，
15%SDS-PAGE 检测 Tαl 融合蛋白获得了高水平表达，表达的融合蛋白主要以可
溶性形式存在于细胞周质。诱导表达菌重悬于 TE（pH8.0）后高压破碎菌体，利
用 Ni2+能与融合蛋白上的多聚组氨酸结合进行 Ni2+柱亲和层析纯化，收集的洗脱
蛋白峰 15%SDS-PAGE 检测纯化效果。通过 BALB/c 小鼠脾淋巴细胞转化实验测
定纯化胸腺素 αl 融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响。试验结果如下：
1.重组质粒 pET-32a-Tαl 转化到大肠杆菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导，用
15% SDS-PAGE 检测胸腺素 αl 的表达。结果显示，用 5mmol/LIPTG 连续诱导 5h，
目的蛋白可实现高效表达。
2.重组菌体溶于 TE 后高压破碎，滤膜过滤后进行 Ni2+柱亲和层析纯化，收
集的洗脱蛋白峰 15%SDS-PAGE 确定纯化效果。结果显示，用 Ni-NTA 树脂可有
效地纯化胸腺素 αl。
3.制备 BALB/c 小鼠脾淋巴细胞悬液，稀释至适宜的细胞浓度，加入到细胞
培养板，CO2 培养箱培养 6h，加入纯化胸腺素 αl，并设置对照，再继续培养 72h。
进一步处理后酶标仪测 OD 值，比较胸腺素 αl 的活性。结果显示，基因工程表
达的胸腺素 αl 明显具有促进淋巴细胞增殖的活性。
关键词：胸腺素 αl；原核表达；Ni2+柱亲和层析；淋巴细胞增殖
目 录
中文摘要 ....... ⅰ
英文摘要 ....... ⅱ
缩略符号....... ⅳ
文献综述 ......... 1
1 前言 ............. 1
2 胸腺激素的分类 ......... 1
3 胸腺素 α1 的发现 ....... 1
4 胸腺素 α1 的结构 ....... 2
5 胸腺素 α1 的来源 ........ 2
6 胸腺素 α1 的分布 ........ 3
7 胸腺素 α1 的生物学功能与生理作用机制 3
7.1 抗肿瘤机制 ............... 4
7.2 拮抗凋亡机制 ........... 4
7.3 免疫调节机制 ........... 5
7.4 其他作用 .. 5
8 胸腺素 α1 的临床应用 5
8.1 胸腺素 α1 在人医的应用 ......... 5
8.2 胸腺素 α1 在畜牧业的应用 ..... 6
9 胸腺素 α1 的制备 ........ 6
9.1 从动物胸腺提取 ...... 6
9.2 化学合成法 ............... 6
9.3 基因工程方法 ........... 7
10 表达系统的选择 ....... 8
研究内容
试验一胸腺素 α1 原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 ............. 10
1 试验材料 ... 10
1.1 质粒和菌株 ............ 10
1.2 试剂 ........ 10
1.3 仪器设备 10
2 试验方法 ... 10
2.1 人工合成胸腺素 α1 ............... 10
2.2 pMD18-T-Tα1 质粒的大量提取............. 11
2.3 pET-32a-Tα1 重组质粒的构建 ............... 12
2.4 Tα1 在大肠杆菌中的诱导表达 .............. 13
2.5 Western blot 印迹分析 ............ 15
3 结果 ........... 16
3.1 Tα1 重组质粒的构建 .............. 16
3.2 Tα1 重组质粒的酶切鉴定 ...... 16
3.3 表达产物的 SDS-PAGE......... 17
3.4 表达产物的 Western blot 鉴定 .............. 17
4 讨论 ........... 18
试验二 胸腺素 α1 的纯化 ........... 20
1 试验材料 ... 20
1.1 试剂 ........ 20
1.2 仪器设备 20
2 试验方法 ... 20
2.1 胸腺素 α1 纯化样品准备 ....... 20
2.2 介质准备 20
2.3 装柱 ........ 20
2.4 纯化 ........ 21
2.5 介质的洗涤及再生 21
2.6 脱盐 ........ 22
3 结果 ........... 22
4 讨论 ........... 24
试验三 胸腺素 α1 的 T 淋巴细胞转化试验 .............. 25
1 试验材料 ... 25
1.1 试剂 ........ 25
1.2 仪器设备 25
1.3 试验动物 25
1.4 试剂配制 25
2 试验方法 ... 26
2.1 淋巴细胞制备 ......... 26
2.2 淋巴细胞转化率检测 ............ 27
2.3 数据处理 27
3 结果 ........... 27
4 讨论 ........... 28
结论 ....... 29
参考文献 ....... 30
致谢 ............... 35
附录 ......... 36
攻读硕士学位期间发表的学术论文 ........... 41