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硕士论文-猪圆环病毒Ⅱ型ORF2全基因的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立，共80页，47481字
摘要
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科圆环病毒属成员，分为 I 型(PCV1)
和 II 型(PCV2)两个型，其基因组为共价闭合环状的单链 DNA，大小约 1.7kb。猪圆环病
毒 ORF2 基因编码病毒的主要结构蛋白 Cap 蛋白，该蛋白具有良好免疫原性。PCV1 和
PCV2 ORF2 基因序列的核苷酸同源性仅为 67%，两种血清型的 Cap 蛋白虽存在共同的
抗原决定簇，但两者没有抗原交叉性，因而是区分 PCV1 和 PCV2 的重要蛋白。PCV2
是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)
等相关疾病的主要病原。给世界养猪业造成巨大的经济损失。了解 PCV2 的流行情况，
可以给 PCV2 的预防和控制提供指导。
根据已测猪Ⅱ型圆环病毒湖南分离株(HN0712)全基因序列，设计一对克隆和表达
HN0607 株 ORF2 全基因(709bp)的引物，将其克隆到原核表达载体 pET-32a 上，经 KpnⅠ、
XhoⅠ酶切，序列测定正确后，将重组表达质粒转化到大肠杆菌 BL21 中，用终浓度
lmmol/L IPTG 诱导，表达产物以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。经 Western-blot 检
测表明，表达的重组蛋白 ORF2 能被 PCV2 阳性血清所识别，具有良好的抗原性。
用镍柱亲和层析法从上清中纯化目的蛋白，以纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚乙
烯微量反应板，初步建立检测 PCV2 抗体的间接 ELISA 方法。试验表明：抗原的最佳包
被浓度为 12.81μg/mL，血清最佳稀释度为 1:20；最佳封闭液为 3%BSA，封闭时间为
37℃1.5h 加 4℃过夜，HRP-鼠抗猪 IgG 的最佳工作浓度为 1:12000，最佳血清及酶标二
抗反应条件及时间均为 37℃ 30min，最佳显色时间为 15min，统计学分析后确定阴阳性
的临界值为 0.490。通过上述建立的 ELISA 方法有良好的特异性，重组蛋白不与猪瘟，
猪伪狂犬病，猪繁殖与呼吸综合征病毒的阳性血清发生交叉反应。该方法为我国进行
PCV2 的快速诊断和血清学调查提供了一种监测手段，为试剂盒的研制和开发奠定了前
期工作基础。
关键词：猪Ⅱ型圆环病毒；ORF2 基因；原核表达；间接 ELISA
目 录
摘 要......... 1
ABSTRACT............. 2
缩略词表... 4
文献综述... 5
前言........... 5
1 猪圆环病毒病原学............. 6
2 病毒的分子生物学.............. 8
3 流行病学............. 14
4 PCV2 相关性疾病............. 19
5 诊断...... 22
6 防制...... 26
试验一猪圆环病毒Ⅱ型 ORF2 基因的克隆与原核表达 28
1 材料..... 28
2 方法..... 33
3 结果..... 43
4 讨论..... 47
试验二 PCV2 间接 ELISA 检测方法的建立.... 51
1 材料..... 51
2 方法..... 53
3 结果..... 57
4 讨论...... 65
全文总结. 68
参考文献. 69
致谢......... 78