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  • 资源分类:生物农医
  • 适用专业:农产品加工及贮藏工程
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资料简介
硕士论文-婴幼儿配方乳粉中IgG活性含量测定方法的研究,共69页,38579字
摘 要
新一代婴幼儿配方乳粉的开发应使其具有和母乳相同或相似的生理功能,不仅在
宏观成分和含量上,还要在微观组成上模拟母乳。因此,为实现婴幼儿配方乳粉的真
正母乳化,对保护性营养物质的研究非常重要。保护性的免疫活性物是婴幼儿配方乳
粉接近母乳的关键,代表了新一代婴幼儿配方乳粉的发展趋势,其中免疫球蛋白G——
IgG是这些保护性的免疫活性物中的重要一种。由于婴幼儿配方乳粉中IgG含量与其他
含IgG产品相比较低,所以目前尚缺乏准确可靠的测定方法。
据此,本论文研究了检测婴幼儿配方乳粉中IgG活性含量的ELISA法以及ELISA试剂
盒,并将自制的ELISA试剂盒与HPLC法进行比较。研究得出的结论为检测婴幼儿配方乳
粉中IgG的低活性含量提供了参数,最终建立了测定婴幼儿配方乳粉中IgG活性含量的
方法——双抗体夹心法。主要结果如下:
(1)标准牛IgG的活性含量检测方法为:以5μg/mL的兔抗牛IgG浓度37℃3h加4℃
保存12h(过夜)包被酶标板;采用含0.01g/mL的BSA(牛血清白蛋白)封闭液37℃封
闭0.5h;待测样品或标准牛IgG的最佳反应时间为1.5h;采用1:250倍比稀释的HRP-兔
抗牛IgG作为酶标二抗反应1h;底物溶液为:50μL TMB使用液+30 μLH2O2+10mL底物缓冲
液,反应20min。所获得的标准曲线方程为:y = 225.45x2 - 21.237x - 1.4713,相
关系数达到0.999以上,标准曲线的相关性好。
(2)通过选择离心时间和溶剂,实验确立乳粉样品的预处理条件:将乳粉样品溶
于PBS溶液中调节pH值到4.5至4.6之间,4000r/min离心15min后,过滤取清液,再次调
节pH值至7.4,定容于100mL容量瓶中。此预处理方法简单且分离效果好。
(3)本研究建立的双抗体夹心法回收率为93.06%~100.12%,变异系数最大为
3.090%,最小为1.200%;板内和板间的检测结果变异系数均小于5%,通过SPSS软件做出
的质量控制图可得知,本方法的稳定性好,测得的数据准确度高。
(4)试剂盒的组装在4℃条件下保存,可保存60d;根据SPSS软件做出的质量控制
图可得知,本试剂盒的稳定性好,测得的数据准确可靠。本研究建立的自制试剂盒在
很大程度上节省试验时间(酶标板包被不需保存12h即过夜,可直接测量),简化实验
步骤。HPLC法与之相比较,得到的数据偏高,准确度低。
关键词:IgG;婴幼儿配方乳粉;活性含量;酶联免疫吸附法;高效液相色谱法;
目录
中文摘要 ....1
英文摘要 ....2
缩略词 .4
前言…………………………………… 5
1 母乳与婴幼儿配方乳粉.. 5
2 免疫球蛋白(Immunoglobulin)简介 7
2.1 免疫球蛋白的结构及分类..... 7
2.2 免疫球蛋白 Ig 的多种生物活性功能 ....... 9
2.3 IgG 在婴幼儿配方乳粉中的应用 .. 11
2.4 IgG 性质研究现状 ...... 12
3 IgG 检测方法的研究现状 ....... 13
3.1 酶联免疫吸附(ELISA)法..... 14
3.2 单向免疫扩散法与双向琼脂扩散法....... 15
3.3 高效液相色谱(HPLC)法 16
3.4 毛细管电泳法( MEKC)和免疫胶体金法(DIGFA). 16
3.5 婴幼儿配方乳粉中 IgG 检测技术的发展趋势. 17
4 本研究的意义和主要内容...... 17
材料与方法……………………………………19
1 材料 . 19
1.1 主要设备 19
1.2 主要材料与试剂 ........ 19
2 方法 . 20
2.1 双抗体夹心法测定标准 IgG 活性含量的研究. 20
2.2 婴幼儿配方乳粉预处理的研究...... 25
2.3 双抗体夹心法的稳定性研究......... 26
2.4 ELISA 法试剂盒的组装及保存试验 ....... 26
2.5 ELISA 试剂盒的操作程序 ... 27
2.6 HPLC 法测定婴幼儿配方乳粉中 IgG 含量的研究 ... 28
结果与讨论…………………………………………29
1 双抗体夹心法测定标准 IgG 活性含量的研究..... 29
1.1 酶标板反应均一性的测定... 29
1.2 包被用 IgG 和酶标二抗种类的选择 ....... 30
1.3 兔抗牛 IgG 最适包被液和 HRP-兔抗牛 IgG 最佳工作浓度的确定 ....... 31
1.4 包被条件的确定 ......... 32
1.5 封闭时间的确定 ........ 33
1.6 待测样品反应时间的确定.... 34
1.7 HRP-兔抗牛 IgG 反应时间的确定 35
1.8 底物溶液中 TMB 浓度的确定 ....... 36
1.9 底物 TMB 反应时间的确定 37
1.10 标准曲线的绘制 ....... 37
1.11 小结....... 38
2 婴幼儿配方乳粉预处理的研究......... 39
2.1 离心时间的选择 ........ 39
2.2 溶剂和处理条件的选择....... 39
2.3 小结 ......... 40
3 双抗体夹心法的稳定性研究.. 40
3.1 方法的回收率试验 ..... 41
3.2 酶标板内重复性试验.. 41
3.3 酶标板间重复性试验.. 42
3.4 双抗体夹心法的质量控制.... 43
3.5 小结 ......... 43
4 ELISA 法试剂盒的保存试验 .. 44
4.1 包被酶标板的保存试验........ 44
4.2 HRP-兔抗牛 IgG 酶标二抗的保存试验 .. 45
4.3 试剂盒的保存 .. 45
4.4 试剂盒的稳定性试验(质量控制)....... 46
4.5 小结 ......... 47
5 HPLC 法测定婴幼儿配方乳粉中 IgG 含量的研究 ...... 48
5.1 IgG 标准曲线的绘制 .. 48
5.2 HPLC 法精密度试验 .. 49
5.3 HPLC 法回收率试验 .. 50
5.4 HPLC 法与 ELISA 试剂盒检测的比较 ... 51
5.5 小结 ........ 52
结 论…………………………53
参考文献 …………………………………54
致 谢 …………………………………57
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