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硕士论文-灰树花发酵液多糖提取及其活性测定，共70页，31082字
摘 要
1、利用平板培养和液体培养比较了 8 个灰树花菌株。发现固体平板培养中，菌株
的平均日生长速度为 5.0～6.5mm/d，菌丝体均为白色，216 菌株、270 菌株和 275 菌株
的菌丝生长量较慢，但是菌丝绒毡状，生长均匀，边缘整齐，菌丝致密。摇瓶培养表明，
菌株间的菌体干重差别不大，粗多糖含量以 270 菌株和 275 菌株最高，分别为 7.7 mg/mL
和 7.8 mg/mL。发酵罐测试表明：随着培养时间的延长，pH 逐渐降低，最后维持在 pH3～
4，菌丝体生长量为 20～22 mg/ml，总糖测试表明 270 菌株和 275 菌株可以达到 30mg/mL，
其它几个菌株略低。
2、采用响应面分析中的 Box-Behnken 试验优化了灰树花胞内多糖提取条件，结果
表明，实验范围内多糖最佳提取条件为提取温度 92.53 ℃，浸提时间 2.24 h，水料比
35.76: 1，在此条件下多糖的理论提取率为 7.28%，验证值为 7.15%。表明响应面法能
够较好的分析提取温度、提取时间及料水比等多个因素对灰树花胞内多糖提取的影响作
用，并且回归方程的预测值与试验值符合度较高。
3、研究了灰树花多糖的提取纯化方法。分别对胞内多糖提取液和胞外多糖提取液
进行浓缩、除色素、脱蛋白处理，并利用乙醇进行分步醇析。实验表明，胞内多糖总产
率为 2.19g/L，胞外多糖总产率为 1.68g/L，胞外多糖产率略低。通过对多糖组分进行
Sephadex G-100 分子筛柱层析，分离到胞内多糖组分 IP30-I、IP60-I、IP60-II 和
IP83-II，得到胞外多糖组分 EP60-I、EP60-II 和 EP83-I。
4、测试了灰树花胞内多糖对 S180 荷瘤昆明小鼠的抑瘤作用。荷瘤小鼠随机分为四
组：低剂量多糖组（200mg/kg.d）、高剂量多糖组（500mg/kg.d）、环磷酰胺阳性对照组
（20mg/k g.d）和生理盐水阴性对照组。给药 10 d 后计算肿瘤抑制率。结果表明：与
阴性对照组相比，低剂量多糖组和高剂量多糖组抑瘤率分别达到 61.51%（P <0.01） 和
44.42%（P <0.01），环磷酰胺组抑瘤率为 73.75%（P <0.01）。测试了灰树花多糖不同组
分对肝癌 Hep 细胞的体外抑制试验，以蒸馏水为阴性对照组、以氟尿嘧啶为阳性对照组。
结果表明：胞内多糖的抑制效果好于胞外多糖，其中最高可以达到抑制率 66%。
5、测定了灰树花发酵液胞内多糖的单糖组份及其摩尔比。将胞内多糖 IP30、IP30-I、
IP60、IP60-I、IP60-II 分别水解为单糖，采用 HPLC 法测定其组成及摩尔比。结果表明：
IP30 含 8 种单糖，IP30-I 则由 7 种单糖组成；IP60 含 7 种单糖，IP60-I 由 6 种单糖组
成，IP60-II 则含 4 种单糖。5 个多糖组份中，都含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖，而且
都以葡萄糖含量最多；除 IP60-II 外其余 4 个组份中都含有 1 种 10 种标准单糖之外的
未知糖，而且 IP60 和 IP60-I 中含量多，仅次于葡萄糖。
关键词：灰树花多糖；响应面法；分离纯化；S180 肉瘤；Hep 细胞；HPLC；单糖组份
目录
摘 要...... i
ABSTRACT......iii
1 前言... 1
1.1 灰树花研究概况...... 1
1.1.1 灰树花生物学特性............. 1
1.1.2 灰树花营养价值... 2
1.1.3 灰树花保健功能... 3
1.1.4 灰树花人工栽培... 3
1.1.5 灰树花深层液体发酵......... 4
1.1.6 灰树花多糖的提取、分离与纯化方法......... 4
1.1.7 灰树花多糖的结构分析..... 5
1.1.8 灰树花多糖的生物活性..... 7
1.1.9 灰树花中海藻糖的研究..... 8
1.1.10 灰树花分子生物学研究... 9
1.2本项目研究意义.... 9
1.3本项研究主要内容............ 10
2灰树花菌株筛选试验............. 12
2.1材料和方法.......... 12
2.1.1材料..... 12
2.1.2方法..... 13
2.2结果.......... 15
2.2.1 固体平板培养..... 15
2.2.2 摇瓶液体发酵..... 16
2.2.3 发酵罐培养......... 17
2.3 小结............ 19
3灰树花胞内多糖提取条件优化........... 20
3.1 材料和方法 20
3.1.1 材料......... 20
3.1.2 方法......... 20
3.2 结果.......... 21
3.2.1 单因素影响试验... 21
3.2.2 响应曲面法分析胞内多糖提取条件 23
3.3 讨论.......... 29
4 灰树花发酵液多糖的分离纯化............. 31
4.1 材料与方法. 31
4.1.1 材料......... 31
4.1.2 方法......... 31
4.2 结果............ 32
4.2.1 灰树花多糖的提取............. 32
4.2.2 灰树花多糖分子筛柱层析. 33
4.3 小结.......... 38
5 灰树花多糖的抗肿瘤作用....... 39
5.1 材料与方法............ 39
5.1.1 材料....... 39
5.1.2 灰树花多糖获取方法......... 39
5.1.3 动物体内试验..... 40
5.1.4 体外细胞试验..... 40
5.2结果.......... 42
5.2.1 灰树花胞内多糖体内抑瘤作用........ 42
5.2.2 灰树花多糖体外抑制肿瘤细胞作用 43
5.3 讨论.......... 44
6 灰树花胞内多糖的单糖组份测定......... 45
6.1 材料与方法............ 45
6.1.1 材料....... 45
6.1.2 方法......... 45
6.2 结果............ 46
6.3 小结............ 49
7 结论及进一步研究的建议....... 51
7.1 结论............ 51
7.2 进一步研究的建议... 52
参考文献........... 53
致谢............. 57