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硕士论文-真姬菇热激蛋白HmHSP70基因克隆及其原核表达分析，共82页，35026字
摘要
真姬菇（Hypsizygus marmoreus）是一种珍稀食用菌品种，以其丰富的营养价值和
广泛的药用价值深受人们的喜爱。真姬菇属于中偏低温型食用菌，温度过高（>25℃）
或过低（<5℃）都会对真姬菇的生产造成较大影响。热激蛋白（heat shock protein, HSP）
是生物体内最重要的一类逆境诱导蛋白，它们在逆境条件下，尤其是温度胁迫下迅速合
成，使细胞免受损伤。HSP 具有分子伴侣的功能，参与各种各样的细胞代谢过程，它们
还与生物体的抗热、抗冷以及抗氧化性密切相关。因此，热激蛋白基因是育种工作中具
有重要实用价值的优良基因。对于热激蛋白的研究国内外主要集中在动物和植物中，关
于真菌热激蛋白的研究鲜有报道，目前为止尚未见有关于食用菌热激蛋白的报道。
本研究以真姬菇品种白真姬菇为材料，采用 cDNA 末端快速扩增（rapid amplification
of cDNA ends, RACE）方法，成功克隆出真姬菇 HSP 基因家族中的一个 HSP70 基因
（HmHSP70），并在大肠杆菌中进行了异源表达，测定了 HmHSP70 蛋白的部分功能。
获得研究结果如下：
1、根据 GenBank 中异丝绵霉 (AKU02504)，光滑假丝酵母(AY077689)，葡枝根霉
(AY147869)等的热激蛋白基因保守序列，使用 Primer Premier5.0 结合 DNAMAN6.0 程
序设计一对简并引物，从真姬菇基因组 DNA 中扩增出 HmHSP70 基因部分片段，经 PCR
鉴定后，将目的片段与 pMD18-T 载体连接，转化到大肠杆菌 DH5α 感受态中，送交上海
生工生物工程服务技术有限公司测序。片段长度为 690bp，编码 230 个氨基酸。
2、根据测序结果，重新设计引物。Trizol 法提取 42℃热激处理 2h 真姬菇菌丝体总
RNA，利用 PT-PCR 和 RACE 技术相结合的方法，克隆出 HmHSP70 基因的 3’和 5’末端。
经 T 载体连接后送交上海生工生物工程服务技术有限公司测序。根据测序结果设计引物
扩增 HmHSP70 基因全长，扩增出 2145bp 的片段，开放性阅读框（open reading frame,
ORF）共 2001bp，编码 667 个氨基酸（GenBank 登录号为 GQ246176）。
3、构建了 HmHSP70 基因的原核表达载体，使重组质粒 pET32a-c(+)/HmHSP70 在
大肠杆菌 BL21(DE3)中异源表达。经 IPTG 诱导后，SDS-PAGE 电泳结果显示得到蛋白
分子量约为 92KDa 的融合蛋白，与预期结果吻合。大肠杆菌经高温（50℃）热激处理
后，通过对大肠杆菌活力的测定和大肠杆菌可溶性蛋白 SDS-PAGE 电泳检测，结果均
表明，HmHSP70 蛋白的异源表达可提高大肠杆菌耐高温的能力，对大肠杆菌中其它蛋
白有较好的保护作用。
4、运用生物信息学的方法，进一步分析真姬菇 HmHSP70 基因的核酸序列和氨基
酸序列。序列分析表明该基因属于 HSP70 基因家族；氨基酸多序列比对的进化树结果
表明，HmHSP70 蛋白氨基序列与双色蜡蘑（XP_001880175）、新型隐球菌（XP_567978）、
棒曲霉（XP_001275300）、裂殖酵母（XP_002172864）的氨基酸序列同源性分别达 87%、
71%、67%、67%；HmHSP70 蛋白分子量为 72.2KDa，等电点(PI, isoelectric point)为 5.63，
不稳定系数为 36.67，疏水性分析为可溶性蛋白。
本试验研究结果为真姬菇品种的改良、真菌热激蛋白研究及真菌的分子育种奠定了
良好的基础。
关键词：真姬菇；热激蛋白；RACE；基因克隆；原核表达

目 录
摘要.... 1
Abstract. 3
缩写词及英汉对照. 5
前 言.... 6
1、立题依据及意义................ 6
2、真姬菇概况....... 7
3、热激蛋白与热激蛋白 70... 8
3.1 热激蛋白研究历史及现状 8
3.2 HSPs 结构上特点 ............ 9
3.3 HSPs 分类 ........ 9
3.4 热激蛋白的功能............. 10
3.5 热激蛋白 70 研究进展... 13
4、全长基因克隆方法的研究进展....... 15
4.1 电子克隆........ 15
4.2 RACE 技术 .... 16
4.3 筛选 cDNA 文库 ............ 17
研究内容
1．真姬菇 HmHSP70 基因的克隆及序列分析.... 18
1.1 试验材料和方法............. 18
1.1.1 试验材料..... 18
1.1.2 试验培养基. 19
1.1.3 试剂............. 19
1.1.4 仪器............. 19
1.1.5 常用溶液的配制.......... 20
1.1.6 菌种培养及保存.......... 21
1.1.7 试验方法..... 21
1.2 试验结果与分析............. 33
1.2.1 真姬菇基因组 DNA 提取及鉴定 33
1.2.2 真姬菇 HmHSP70 基因部分片段的 PCR 扩增 .......... 34
1.2.3 扩增条件的优化........ 35
1.2.4 真姬菇 HSP70 基因部分片段的转化 .......... 35
1.2.5 重组质粒的鉴定.......... 35
1.2.6 序列测定与分析.......... 36
1.2.7 特异引物的鉴定.......... 38
1.2.8 RNA 提取 .... 38
1.2.9 3’RACE 和 5’RACE 扩增真姬菇 HmHSP70 3’末端和 5’末端.. 39
1.2.10 HmHSP70 全序列的拼接........... 39
1.2.11 真姬菇 HmHSP70 基因完整 ORF 的扩增 ................ 41
1.3 讨论................ 44
1.3.1 真姬菇菌丝体总 RNA 的提取 .... 44
1.3.2 PCR 与 RACE 技术的应用 ......... 45
2．真姬菇 HmHSP70 基因原核表达 及耐热功能研究....... 47
2.1 试验材料和方法............. 47
2.1.1 试验材料..... 47
2.1.2 试验仪器..... 47
2.1.3 常用溶液的配制.......... 47
2.1.4 试验方法..... 48
2.2 结果与分析.... 50
2.2.1 HmHSP70 基因在大肠杆菌 BL21 中的表达 ............... 50
2.2.2 异源表达 HmHSP70 基因提高大肠杆菌在高温胁迫下的生存能力........... 51
2.3 讨论................ 53
3. 真姬菇 HmHSP70 基因的生物信息学分析..... 55
3.1 材料与方法.... 55
3.1.1 试验序列..... 55
3.1.2 真姬菇 HmHSP70 核酸序列分析................ 55
3.1.3 真姬菇 HmHSP70 蛋白序列分析................ 55
3.1.4 同源性分析及系统发育分析....... 55
3.2 结果与分析.... 55
3.2.1 核酸序列分析结果...... 55
3.2.2 氨基酸序列分析.......... 56
3.2.3 同源性分析及系统进化分析....... 58
3.3 讨论................ 64
3.3.1 HSP70 与生物进化 ...... 64
3.3.2 生物信息学在分子生物学中的应用............ 64
结论.. 65
参考文献............... 66
附录.. 71
致谢.. 74