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硕士论文-乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌致小鼠乳房炎疗效的研究，共61页，34801字
摘 要
为了提高奶牛乳房炎的治疗效果，减少传统抗生素治疗过程中的耐药性和药残问
题，保障动物性食品安全，亟需找到一种安全、高效的治疗方法。乳铁蛋白是一种具有
广谱抗菌活性的蛋白质，能否将其用于治疗奶牛乳房炎，目前还未见明确报道。为了验
证乳铁蛋白治疗奶牛乳房炎的可行性和治疗效果，本研究分别从提纯奶牛初乳中乳铁蛋
白、建立小鼠乳房炎模型和乳铁蛋白对该模型的治疗效果三个方面进行了研究，研究结
果如下：
1、奶牛初乳离心除去乳脂，经不同浓度的饱和硫酸铵沉淀离心，获得乳铁蛋白粗
提品。乳铁蛋白粗品经 pH8.0 的 PBS 透析至无 NH4+和 SO42-，上 SephadexG-100 柱，用
0.01M pH8.0 的 PBS 缓冲液进行洗脱，收集出现蛋白峰的洗脱液，即为乳铁蛋白的纯品。
经 SDS-PAGE 电泳鉴定，乳铁蛋白的分子量为 80KD 左右，紫外分光光度计检测初乳中
乳铁蛋白浓度为 1.836mg/mL。
2、无菌取乳房炎病牛的乳汁，经分离鉴定，选取致病性的金黄色葡萄球菌，用灭
菌生理盐水分别配制成浓度为 1.0×105CFU/mL 和 2.0×105CFU/mL 的菌悬液。对 30 只孕
鼠分别经第 4 对乳房基部注射 50μL 的灭菌生理盐水、1.0×105CFU/mL 和 2.0×105CFU/mL
的金黄色葡萄球菌悬液，分为对照组、低浓度感染组、高浓度感染组，每组 10 只。24h
后，观察感染小鼠的临床症状，第 4 对乳腺的组织学变化。
结果发现，24h 内高浓度组小鼠出现明显的乳房炎临床症状，低浓度组症状较轻，
对照组未出现任何症状。剖检发现，感染小鼠乳腺及周围组织有广泛的充血、出血现象，
乳腺局部肿胀变硬，有炎性产物渗出。组织切片显示，乳腺结构部分崩塌，间质变宽，
模糊不可辨认，腺泡腔内有大量炎性细胞浸润，以嗜中性粒细胞为主，小叶间导管均有
不同数量的红细胞浸润。临床症状和组织切片结果表明，本试验成功建立了小鼠乳房炎
模型。
3、将上述分离保存的金黄色葡萄球菌在固体培养基上活化，配制浓度为 1.0×
106CFU/mL 的菌悬液，用标准试管二倍稀释法测定 BLF 对金黄色葡萄球菌的 MIC。将
MIC 菌液降低 3 个数量级，培养计数菌落数作为标准，BLF 梯度菌液培养的菌落均值小
于标准菌落的 BLF 浓度即为杀菌浓度（MBC）。用分光光度计测定金黄色葡萄球菌 0，
1，2，4，6，8，12，16，24，36，48，72h 菌液在 600nm 波长的吸光度值，绘制杀菌
曲线。将 30 只乳房炎小鼠，随机分为对照组和实验组，每组 10 只。第 4 对乳房基部注
射 50μL 3 倍 MIC 的 BLF 和等量的生理盐水，8h 注射一次，连注 3 次。24h 和 48h 后，
剖杀小鼠，观察感染小鼠的存活率、临床症状和第 4 对乳腺的组织学变化。
结果表明，BLF 对金黄色葡萄球菌的 MIC 为 2mg/mL，同时证明 BLF 对金黄色葡
萄球菌具有一定的杀菌作用，杀菌浓度为 6mg/mL。BLF 体内治疗试验证明，BLF 在小
鼠体内对乳房炎致病性金黄色葡萄球菌性同样有抑制作用，且体内抑菌作用与用药时间
正相关。
关键词：乳铁蛋白；乳房炎；小鼠；治疗
目 录
中文摘要.........1
英文摘要.........3
英文缩写词与名词解释............. I
前言.................1
文献综述.........1
1 乳铁蛋白的研究进展 ..............1
1.1 乳铁蛋白的结构特性 ...........1
1.2 乳铁蛋白的抗菌活性 ...........2
1.3 与抗菌作用相关的生物学作用 .......................3
1.4 抗菌机制...4
1.5 乳铁蛋白的应用现状与前景 ...........................6
2 乳房炎的研究进展..................7
2.1 概述...........7
2.2 乳房炎的分类.......................8
2.3 乳房炎的致病因素.............10
2.4 乳房炎的诊断.....................12
2.5 乳房炎的治疗.....................13
试验一 乳铁蛋白的提取纯化.15
1 材料............15
1.1 试验材料.15
1.2 主要仪器.15
1.3 试剂或溶液的配制.............16
2 试验方法....16
2.1 初乳中乳铁蛋白的粗提.....16
2.2 初乳中乳铁蛋白的纯化.....17
2.3 乳铁蛋白含量的测定 .........18
2.4 SDS-PAGE 电泳鉴定........ 18
3 试验结果....18
3.1 乳铁蛋白的含量.................18
3.2 SephadexG-100 纯化.........18
3.3 SDS-PAGE 电泳................ 19
4 讨论............20
4.1 乳铁蛋白的粗提.................20
4.2 牛乳中乳铁蛋白的含量.....20
4.3 层析纯化及电泳分析 .........20
5 结论............20
试验二 小鼠乳房炎模型的建立.........................22
1 材料............22
1.1 实验动物.22
1.2 菌种.........22
1.3 主要仪器.22
1.4 培养基配制.........................22
2 试验方法....23
2.1 致病菌的分离鉴定.............23
2.2 乳房炎模型的建立.............24
3 结果...........26
3.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定 .........................26
3.2 感染 24h 小鼠的临床及剖检变化.................28
3.3 乳房炎小鼠组织切片结果 .28
4 讨论............29
4.1 模型动物的选择.................29
4.2 致病菌的选择.....................29
4.3 临床症状和病理变化 .........29
5 小结............29
试验三 牛乳铁蛋白对乳房炎的治疗效果 .........31
1 材料............31
1.1 试验材料.31
1.2 仪器设备.31
1.3 培养基和溶液的配置 .........32
2 实验方法....32
2.1 最小抑菌浓度的测定 .........32
2.2 最小杀菌浓度的测定 .........32
2.3 体内治疗效果试验.............33
3 结果............33
3.1 BLFA 对金黄色葡萄球菌的 MIC................ 33
3.2 BLF 对金黄色葡萄球菌的 MBC..................33
3.3 BLF 的杀菌曲线................35
3.4 乳腺组织细菌计数............37
4 讨论............37
4.1 BLF 对金黄色葡萄球菌的 MIC...................37
4.2 BLF 对金黄色葡萄球菌的 MBC..................37
4.3 BLF 对金黄色葡萄球菌的体内治疗效果 ....37
5 小结............38
结论...........39
参考文献.......40
致谢...........44
硕士在读期间发表的论文 .......45