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硕士论文-农杆菌介导小反刍兽疫病毒H、F基因转化苜蓿的初步研究，共74页，39544字
摘 要
本文利用农杆菌介导法，将小反刍兽疫病毒 H 基因转入苜蓿中，为制备防治小反刍兽
疫的转基因牧草疫苗奠定基础。
小反刍兽疫病毒（PPRV）植物表达载体的构建是采用 TA 克隆的方法，从 PPRV 质粒中
分别扩增出 H，F 基因，在 H 基因终止密码子前加入 KDEL 序列，形成 H-KDEL，烟草 SRI 中
扩增出促进外源基因表达的 MAR12 序列和 MAR34 序列，pHL005 质粒中扩增出报告基因-绿
色荧光蛋白 GFP 基因，以上克隆均带有相应酶切位点，结果显示所克隆的基因和序列均与
理论大小相符，说明各种克隆载体构建成功。将 GFP 基因插入到表达载体 pBI121 替代 GUS
基因，便于植物活体组织检测；将 PPRV-H、PPRV-H-KDEL 基因插入到 pBI121-GFP，构建植
物表达载体 pBI121-GFP-H 和 pBI121-GFP-H-KDEL；将 MAR 序列插入到 pBI121-GFP 基因的
一侧 ，构成中间载体 MAR-pBI121-GFP ，再将 PPRV-H 、PPRV-H-KDEL 、PPRV-F 插入
MAR-pBI121-GFP，从而构成植物表达载体 MAR-pBI121-GFP-H、MAR-pBI121-GFP-H-KDEL 和
MAR-pBI121-GFP-F。经酶切、PCR 检测上述植物表达载体都构建正确。
成功构建表达载体后，用苜蓿品种甘农 1 号下胚轴为外植体，通过冻融法将植物表达
载体 pBI121-GFP-H 转入农杆菌 EHA105 中。并且进一步采用叶片预培养 3d，用农杆菌菌液
侵染 15min，在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养 3d 后清洗，选择压为 Km 75mg/L，抑菌浓
度为 Cef 300mg/L 的措施优化了转化体系。在后续的筛选培养后获得具有卡那霉素抗性的
愈伤组织，但没有得到抗性植株。经紫外灯照射，没有发现绿色荧光，提取苜蓿愈伤组织
基因组的 DNA，用 PCR 鉴定没有得到阳性愈伤组织，今后需要进一步研究。
关键词：小反刍兽疫病毒；苜蓿；表达载体构建；根癌农杆菌；遗传转化
目录
中文摘要............................ I
英文摘要.......................... II
主要英文缩略词............. IV
1 文献综述....................... 1
1.1 苜蓿基因工程的研究进展............... 1
1.1.1 苜蓿遗传转化的研究进展............ 1
1.1.2 苜蓿在生产疫苗中的应用............ 5
1.1.3 苜蓿基因工程的前景和局限性.... 6
1.2 小反刍兽疫研究进展....................... 7
1.2.1 小反刍兽疫概况..... 7
1.2.2 小反刍兽疫病毒学........................ 7
1.2.3 小反刍兽疫的临床学研究............ 9
1.2.4 小反刍兽疫的预防与控制.......... 10
1.2.5 小反刍兽疫病毒蛋白表达和病原诊断技术国内外研究概况........................11
1.2.6 当前存在的问题及展望...............11
1.3 转基因植物疫苗的研究现状......... 12
1.3.1 转基因植物疫苗.......................... 12
1.3.2 转基因植物疫苗的研究现状及应用................. 12
1.3.3 转基因植物疫苗的优点及存在的问题............. 13
1.3.4 转基因植物疫苗的研究及应用前景................. 14
1.4 目的意义................... 15
2 小反刍兽疫病毒 H、F 基因及表达载体相关序列克隆 .............. 16
2.1 试验材料.................. 16
2.1.1 菌株和质粒........... 16
2.1.2 载体....................... 16
2.1.3 酶与化学试剂....... 16
2.1.4 仪器材料............... 16
2.2 试验方法.................. 16
2.2.1 目的基因的 PCR 扩增 ............. 16
2.2.2 各个基因的 TA 克隆 .................. 17
2.2.3 重组质粒的鉴定.......................... 19
2.3 结果与分析.............. 19
2.3.1 目的基因片段 PCR 扩增结果.... 19
2.3.2 重组质粒单酶切鉴定.................. 20
2.3.3 重组质粒双酶切鉴定.................. 21
3 植物表达载体的构建........................ 22
3.1 试验材料.................. 22
3.1.1 菌株与载体........... 22
3.1.2 酶和试剂............... 22
3.1.3 仪器材料............... 22
3.2 试验方法.................. 22
3.2.1 中间表达载体 PBI121-GFP 的构建 ................. 22
3.2.2 植物表达载体 PBI121-GFP-H、PBI121-GFP-H-KDEL 的构建 ............... 23
3.2.3 中间表达载体 PBI121-GFP-MAR 的构建 ...... 23
3.2.4 植物表达载体 PBI121-GFP- MAR-H、PBI121-GFP- MAR-H-KDEL 的构建 ............... 24
3.2.5 植物表达载体 PBI121-GFP-MAR-F 的构建 ......................... 24
3.2.6. 植物表达载体 PBI121-GFP-H 转入到农杆菌 ...................... 24
3.3 结果与分析.............. 25
3.3.1 表达载体 PBI121-GFP、PBI121-GFP-H、PBI121-GFP-H-KDEL 的构建..................... 25
3.3.2 表达载体 PBI121-GFP-MAR-H、PBI121-GFP-MAR-H-KDEL 和 PBI121-GFP-MAR-F
的构建...... 26
3.3.3 表达载体 PBI121-GFP-H 转入农杆菌的验证 ....................... 29
4 农杆菌介导的苜蓿遗传转化............ 30
4.1 试验材料.................. 30
4.1.1 供试苜蓿品种....... 30
4.1.2 菌株和载体........... 30
4.1.3 培养基................... 30
4.1.4 主要生化试剂及其配制.............. 30
4.2 试验方法.................. 31
4.2.1 农杆菌的活化及菌液制备.......... 31
4.2.2 Km 筛选浓度的确定 ................... 31
4.2.3. 头孢霉素（Cef）浓度的筛选 .......................... 31
4.2.4 根癌农杆菌介导的苜蓿的遗传转化................. 31
4.2.5 苜蓿愈伤组织总 DNA 的提取与检测 .............. 32
4.3 结果与分析.............. 33
4.3.1 卡那霉素（Km）筛选浓度的确定 .................. 33
4.3.2 头孢霉素（Cef）浓度的确定.... 34
4.3.3 预培养时间对愈伤组织诱导率的影响............. 34
4.3.4 侵染时间对愈伤组织诱导率的影响................. 35
4.3.5 共培养时间对愈伤组织诱导率的影响............. 35
4.3.6 转基因苜蓿的检测....................... 36
5. 讨论与展望................ 37
5.1 植物表达载体的改造..................... 37
5.1.1 关于 KDEL 序列 ........................ 37
5.1.2 关于 GFP 基因..... 37
5.1.3 关于 MAR 序列 .......................... 37
5.2 关于酶切位点.......... 39
5.3 关于去磷酸化.......... 39
5.4 影响农杆菌介导转化效率因素的研究................ 39
5.4.1 农杆菌菌株对转化的影响.......... 39
5.4.2 预培养、侵染时间、共培养时间的确定......... 39
5.4.3 关于抗性植株....... 40
5.5 后续工作思路.......... 40
6. 结论............................ 43
参考文献......................... 44
致谢.......... 50
附录.......... 51