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硕士论文-萝卜离体再生体系及小孢子和原生质体分离方法的研究，共60页，32300字
摘
要
本研究以萝卜品种‘鲁萝卜一号’及两个萝卜自交系（W、R）为试材，对萝卜组
织和器官的离体培养体系以及小孢子、原生质体的分离方法进行了研究，以探索萝卜离
体培养和再生途径，为萝卜的遗传转化、体细胞杂交等生物技术育种提供依据。获得的
主要结果如下：
1. ‘鲁萝卜一号’离体再生体系的探讨 带下胚轴的茎端为不定芽诱导的最适外植
体；MS + 3 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA 为不定芽诱导的最适培养基，MS + 3 mg/L 6-BA
+ 0.2 mg/L NAA 为不定芽继代增殖的适宜培养基，但在该种培养基上继代 5 次后，需适
当提高 6-BA 浓度，才能保持较高的增殖水平。以半子叶为外植体，培养基为 MS + 3 mg/L
6-BA + 0.3 mg/L NAA 时，有利于愈伤组织的诱导；在此培养基中添加 5 mg/L AgNO3 有
利于愈伤组织的继代与保存；将愈伤组织转接在培养基 MS + 6 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L
NAA+5 mg/L AgNO3 上，获得了再分化芽。
2. 自交系 W、R 离体再生体系的探讨
W、R 自交系都是以 MS + 3 mg/L 6-BA + 0.3
mg/L NAA 为不定芽诱导最适培养基，以 MS + 5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA 为不定芽继
代增殖最适培养基。W、R 都是以半子叶为外植体时愈伤组织的诱导效果最好；W 以
MS + 3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA 培养基愈伤组织的诱导率较高，R 以 MS + 3 mg/L
6-BA + 0.3 mg/L NAA 培养基愈伤组织的诱导率较高；W、R 都是分别在各自最适的愈
伤组织诱导培养基中添加 5 mg/L AgNO3 作为继代培养基时继代效果最好。
3. 种子春化的萝卜茎端离体培养
萌动的种子经酒精消毒 1 min 后，于 4 ℃下处
理 30 天，供试的三个品种（系）均可顺利通过春化。将经春化的种子播种于培养基上，
获得无菌苗后，切取茎端，利用上述所筛选的培养基配方，进行芽的诱导和继代；将获
得的芽再转接于成苗培养基 MS + 0.2 mg/L NAA 上，30 天后可见瓶内开花植株。
4. 萝卜小孢子分离方法的研究
每次挤压处理 20 个花蕾可以获得质量好、数量适
宜的游离小孢子；通过 30/40/50 蔗糖密度梯度离心，可以获得清晰的两条带，经检测第
一条带为大部分处于单核期的小孢子层。由 4 ℃处理 2 天的温室植株花蕾、温室植株花
蕾、组培瓶中花蕾分离的小孢子活力前两者差异显著，后两者差异不显著。
5. 萝卜原生质体分离方法的研究
子叶和下胚轴两种材料均在 12-14 h 时酶解效果
最好。在最佳酶解时间下，子叶的酶解产量均达到下胚轴的 10 倍。利用两种酶组合处
理，在子叶和下胚轴两种材料上酶解对比发现，用 Cellulase Onozuka R-10 + Macerozyme
R-10 酶组合酶解的原生质体比 Cellulase Onozuka R-10 + Pectolyase Y-23 产量高，质量好。
关键词：萝卜；不定芽；愈伤组织；小孢子；原生质体

目录
中文摘要 .............. ⅰ
英文摘要 .............. ⅲ
缩略词表 .............. ⅴ
前言.........1
文献综述....................2
1 植物组织器官离体再生及小孢子、原生质体分离培养研究进展...................2
1.1 植物组织器官离体再生研究进展...........2
1.2 小孢子的分离、培养研究进展...............4
1.3 原生质体分离研究进展........7
2 萝卜的离体培养研究进展.......9
研究内容..................11
1 萝卜离体再生体系研究.........11
1.1 材料与方法.......11
1.1.1 植物材料........11
1.1.2 ‘鲁萝卜一号’离体再生体系的探讨.................11
1.1.2.1 无菌苗的获得................11
1.1.2.2 芽诱导适宜外植体和培养基的筛选..................11
1.1.2.3 芽继代适宜培养基的筛选...............11
1.1.2.4 愈伤组织诱导适宜外植体和培养基的筛选......11
1.1.2.5 愈伤组织的继代及再分化研究.......12
1.1.3 萝卜自交系 W、R 离体再生体系的探讨 ............12
1.1.3.1 无菌苗的获得................12
1.1.3.2 芽和愈伤组织诱导条件的筛选.......12
1.1.3.3 芽和愈伤组织的继代、再分化研究 ..................12
1.1.4 种子春化的萝卜茎端离体培养..........12
1.1.4.1 萝卜种子的春化............12
1.1.4.2 春化萝卜无菌苗的获得...................12
1.1.4.3 春化萝卜的茎端快繁及离体成花......................12
1.2 结果与分析.......12
1.2.1 ‘鲁萝卜一号’的离体再生体系......13
1.2.1.1 芽诱导适宜外植体和培养基的筛选..................13
1.2.1.2 芽继代适宜培养基的筛选...............13
1.2.1.3 愈伤组织诱导适宜外植体和培养基的筛选......13
1.2.1.4 愈伤组织的继代培养及再分化.......15
1.2.2 萝卜自交系 W、R 的离体再生体系 ....................16
1.2.2.1 芽和愈伤组织诱导条件的筛选.......16
1.2.2.2 芽和愈伤组织的继代、再分化.......18
1.2.3 种子春化的萝卜茎端离体培养..........18
1.2.3.1 萝卜种子的春化............18
1.2.3.2 春化萝卜的茎端快繁及离体成花......................19
1.3 讨论...................19
1.3.1 关于萝卜离体再生途径......................19
1.3.2 关于萝卜芽诱导和增殖......................19
1.3.3 关于萝卜愈伤组织诱导、继代及再分化.............20
1.3.4 关于萝卜的春化与离体成花..............20
2 萝卜小孢子分离方法的研究..................21
2.1 材料与方法.......21
2.1.1 植物材料........21
2.1.2 机械法分离获得游离小孢子..............21
2.1.3 游离小孢子的离心选择......................21
2.1.4 小孢子的活力检测...........22
2.2 结果与分析.......22
2.2.1 小孢子的分离...................22
2.2.2 小孢子的离心选择...........22
2.2.3 小孢子的活力检测...........24
2.3 讨论...................25
3 萝卜原生质体分离方法的研究................26
3.1 材料与方法.......26
3.1.1 植物材料........26
3.1.2 解离材料的获取...............26
3.1.3 原生质体解离酶液的配制..................26
3.1.4 原生质体的解离与纯化......................27
3.1.5 原生质体产量的测定.......27
3.2 结果与分析.......28
3.2.1 酶解时间对子叶和下胚轴原生质体解离效果的影响............28
3.2.2 不同酶及酶解材料对原生质体产量的影响.........28
3.2.3 两种酶组合酶解效果对比..................29
3.3 讨论...................30
结论..........................32
参考文献..................33
图版..........................37
附录..........................43
致谢..........................45