学海网

硕士论文-大白菜CcPAT1基因的克隆及其超表达转基因植株的构建，共80页，39768字
摘 要
拟南芥 PAT1(phytochrome A signal transduction1)基因特异地在 PhyA 信号传导途径
的早期起作用。但这个基因在大白菜（Brassica campestris L.ssp.pekinensis）中未见研究。
本试验在自交系大白菜福山包头中，分离了拟南芥(Arabidopsis thaliana )PAT1 基因的同
源基因，命名为 CcPAT1（Chinese cabbage PAT1），构建了 CcPAT1 基因的超表达载体
pCAMBIA2300-CcPAT1。为研究大白菜 CcPAT1 基因的功能，我们将该基因转化拟南芥，
获得了相应的转基因植株。同时，由于大白菜的离体再生相当困难，是蔬菜中最难脱分
化和再分化的，这使得其转基因研究难以进行。我们建立了以下胚轴为外植体的高效稳
定再生遗传转化体系和以子叶-子叶柄为外植体的高效稳定再生体系，以期将大白菜
CcPAT1 基因转入大白菜，对其表达和基因功能作进一步的分析。本研究对进一步利用
CcPAT1 基因进行大白菜遗传改良有重要的理论价值。
主要结果如下：
1 CcPAT1 基因的克隆
获得一条分子质量约为 1500bp 的均一扩增条带，经测序，该 DNA 片段为 1494bp，
与预期的目的片段大小一致。构建的超表达载体 pCAMBIA2300-CcPAT1 经 PCR、酶切
验证，证明目的片段 CcPAT1 基因已经连接到表达载体 pCAMBIA2300 上。
2 PCR 及测序鉴定转基因拟南芥
采用根癌农杆菌介导的浸花法侵染拟南芥，获得 30 棵左右转基因植株。随机提取 2
株拟南芥基因组 DNA，以 35S 启动子的下游引物序列 P35SL 和 CcPAT1 基因的下游引
物序列 ccpat1a，扩增外源 CcPAT1 基因，均扩增出 1500bp 左右的片段，表明 2 棵拟南
芥均是阳性植株。
将上述 PCR 扩增出来的目的片段测序结果与拟南芥 PAT1 基因及我们克隆的
CcPAT1 基因序列比对，结果表明导入拟南芥的外源基因与大白菜 CcPAT1 基因完全相
同。因此，获得了可以超表达 CcPAT1 基因的拟南芥转基因植株。
3 转基因拟南芥的表型观察
侵染后的植株在 1/2MS 培养基上筛选 6-7 天后，转基因植株子叶深绿，根系不如野
生型发达，而且比野生型晚发育 1-2 天。将转基因与野生型幼苗移栽入基质和蛭石的混
合培养基 20d 左右的时间内，转基因植株和野生型植株几乎没有表型变化。继续观察，
拟南芥植株到初达开花期时，可以观察到转基因植株和野生型相比较，植株矮小，羸弱，
叶片变小，发育较晚。
4 以下胚轴为外植体的大白菜稳定高效再生遗传转化体系的建立：
1）转化频率最高的基因型是 Seoul，最佳筛选培养基配比是 MS+2mg/L 6-BA+ 1
mg/L NAA+2 mg/L AgNO3+300 mg/L Car+10 mg/L Hyg，pH5.8，侵染液浓度 OD600=0.5，
侵染时间为 10min。
2）以大白菜杂交系 Seoul 下胚轴为外植体，与农杆菌共培养两天后做 GUS 瞬时染
色，发现下胚轴都能染出蓝色，说明外源基因已经进入植物细胞体内并且表达。
3）共培养后将外植体置于分化培养基上培养，10 天左右后抗性愈伤长出，3 周后
抗性愈伤上分化出抗性芽。取愈伤组织及芽 GUS 染色后发现变成蓝色，说明 GUS 基因
已经整合进细胞的染色体中，并且稳定表达。但我们从抗性芽很难得到阳性植株，原因
可能是：大白菜杂交系的分化能力差，阳性芽褐化严重，极易死亡。在今后的试验中，
还需要进一步摸索防褐化条件，减少抗性芽的死亡，以期获得转基因植株。
5 以带柄子叶为外植体的大白菜稳定高效再生体系的建立：
再 生 频 率 最 高 的 基 因 型 是 北 京 新 2 号 ， 最 佳 分 化 培 养 基 配 是 MS+5mg/L
6-BA+0.5mg/L NAA+4mg/L AgNO3，pH5.8
6 以大白菜杂交系北京新 2 号带柄子叶为外植体，与农杆菌共培养两天后做 GUS 瞬时
染色，发现子叶柄都能染出蓝色，说明外源基因已经进入植物细胞体内并且表达。但是，
本试验中，经农杆菌侵染的大白菜外植体子叶-子叶柄在含有潮霉素的筛选培养基中，
一方面很容易褐化和白化死亡，另一方面，得到的再生苗都是假阳性的，一直没有得到
的抗性芽或抗性苗，所以，没有办法研究影响大白菜遗传转化的因素，这也是今后我们
试验所要努力的方向。
关 键 词 ： 拟 南 芥 （ Arabidopsis thaliana ）； 大 白 菜 （ Brassica campestris
L.ssp.pekinensis） ；CcPAT1 基因；转基因植株；遗传转化体系

目录
中文摘要………………………………………………...i
英文摘要…………………………………………iii
缩略词表 …………………………………….v
前言……………………………………………….1
1 本研究的目的和意义……………………………………….1
2 植物光敏色素分子 ...... 1
3 光敏色素信号传导途径...............................5
4 PAT1（phytochrome A signal transduction)基因的研究进展.....6
5 芸薹属植物基因工程研究进展研究内容 ..7
6 大白菜组织培养主要再生途径…………………………………………….…….………….……………8
7 大白菜遗传转化研究进展..........................10
8 农杆菌介导的转化植株征..........................11
研究内容
1 大白菜 CcPAT1 基因的分离和超表达载体的构建
1.1 试验材料...................12
1.1.1 试验材料................12
1.1.2 质粒和菌株............12
1.1.3 主要酶和试剂........12
1.1.4 所用溶液及其配制12
1.2 试验方法...................13
1.2.1 PCR 引物设计.......13
1.2.2 大白菜总 RNA 的提取（TriZol Kit 方法）........................14
1.2.3 RNA 甲醛变性胶电泳检测..................15
1.2.4 反转录 cDNA 第一链的合成...............16
1.2.5 目的基因的获得....16
1.2.6 连接反应................17
1.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....17
1.2.8 质粒 DNA 的酶切鉴定.........................18
1.2.9 序列测定................19
1.2.10 CcPAT1 超表达载体的构建................19
1.3 结果与分析...............20
1.3.1 大白菜福山包头总 RNA 质量的检测..20
1.3.2 CcPAT1 基因片段的 RT-PCR 扩增.......21
1.3.3 CcPAT1 基因重组质粒 pGEM-PAT1 鉴定...........................21
1.3.4 序列分析及同源性比较........................22
1.3.5 CcPAT1 基因超表达载体的构建..........23
1.4 讨论...........................24
1.4.1 大白菜 CcPAT1 基因序列特征分析.....24
2 根癌农杆菌介导的浸花法转化拟南芥
2.1 试验材料...................25
2.1.1 试验材料.............,..25
2.1.2 菌株........................25
2.1.3 所用溶液及其配制25
2.2 试验方法...................25
2.2.1 大白菜基因组 DNA 的提取（SDS 法）..............................25
2.2.2 农杆菌介导的遗传转化........................26
2.2.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化............27
2.2.4 转基因植株观察....28
2.3 结果与分析...............29
2.3.1 转基因植株的 PCR 检测......................29
2.3.2 转基因植株的 PCR 产物测序..............29
2.3.3 转基因拟南芥植株的表型观察............30
2.4 讨论...........................32
2.4.1 转基因拟南芥的 PCR 检测..................32
3 大白菜下胚轴作外植体高效遗传转化体系的建立
3.1 试验材料..................34
3.1.1 试验材料...............34
3.1.2 质粒与菌株...........34
3.1.3 实验用培养基及其配制........................34
3.2 试验方法...................35
3.2.1 无菌苗的培养........35
3.2.2 大白菜高效再生体系的建立................35
3.2.3 影响外植体再生的因素........................36
3.2.4 根癌农杆菌介导的大白菜遗传转化体系的建立................36
3.3 结果和分析...............37
3.3.1 不同基因型、苗龄外植体对再生频率的影响....................38
3.3.2 下胚轴切段来源和接种方式对不定芽再生的影响............39
3.3.3 不同预培养天数对转化频率的影响....40
3.3.4 不同共培养基对转化频率的影响........41
3.3.5 菌液浓度和侵染时间对转化频率的影响............................41
3.3.6 AgNO3 浓度对转化频率的影响...........42
3.3.7 激素浓度及组合对不定芽分化率的影响............................43
3.3.8 潮霉素（Hyg）浓度对转化频率的影响..............................44
3.3.9 抗性芽的 GUS 组织化学染色法鉴定...44
3.4 讨论...........................45
3.4.1 不同基因型对再生芽频率的影响........45
3.4.2 不部位和接种方式对不定芽再生的影响............................45
3.4.3AgNO3 对抗性芽再生率的影响...........46
3.4.4GUS 染色检测.......46
3.5 结论..........................46
4 大白菜子叶-子叶柄作外植体高效再生体系的建立
4.1 试验材料..................49
4.1.1 试验材料................49
4.1.2 质粒构建与菌株....49
4.1.3 实验用培养基及其配制........................49
4.2 试验方法...................50
4.2.1 无菌苗的培养......50
4.2.2 高效再生体系的建立..........................50
4.2.3 影响子叶-子叶柄再生的因素.............50
4.2.4 根癌农杆菌介导的大白菜高效遗传转化体系的建立.......50
4.2.5 子叶柄的 GUS 瞬时染色法鉴定.........51
4.3 结果和分析..............52
4.3.1 不同基因型、苗龄外植体对再生频率的影响...................52
4.3.2 不同激素浓度及组合对不定芽分化率的影响...................53
4.3.3 再生芽的生根和移栽...........................54
4.3.4 子叶柄的 GUS 瞬时染色法鉴定.........54
4.3.5 根癌农杆菌介导的大白菜高效遗传转化体系的建立.......55
4.4 结论..........................55
全文结论........................57
参考文献........................59
致谢64