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硕士论文-地鳖虫中提取抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的研究，共64页，31403字
摘 要
阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)，是最常见的以进行性痴呆为特征的大脑退行
性变性疾病。它严重影响患病者的认知功能、记忆功能、社会生活能力、个人生活能力
等。目前，世界上较为接受的AD病理为“胆碱能缺失学说”。学说认为大脑内神经递质
—乙酰胆碱的缺失是导致AD疾病的关键原因。现今对AD的治疗主要是采用乙酰胆碱酯
酶抑制剂（如他克林、加兰他敏、石杉碱甲等）来抑制乙酰胆碱酯酶，提高患者体内的
乙酰胆碱水平，延缓乙酰胆碱的水解速度，从而发挥其对AD的治疗作用。目前，国内
研究的乙酰胆碱酯酶抑制剂大都来源于植物和微生物，如刘嘉林、徐择邻等分别从蛇足
石杉和华南马尾杉中分离得到石杉碱甲；董悦生等从2141株放线菌中筛选到一株具有抑
制乙酰胆碱酯酶活性的阳性菌株N-98-1021A。然而对于昆虫的研究甚少，更无从地鳖虫
中提取乙酰胆碱酯酶抑制剂的相关报道。地鳖虫是传统的活血化瘀药，中医临床上用于
治疗冠心病、高血压病。而且它还含有多种氨基酸、微量元素、脂肪酸等，具有抗凝血、
抗缺氧、降血脂、抗突变等作用。因此，本文选用地鳖虫为原料，以对乙酰胆碱酯酶的
抑制活性为指标，对抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的提取工艺进行优化，并对所得提取物
进行分离，分离结果采用GC/MS进行初步探究。本论文研究的内容及结果如下：
1 抑制乙酰胆碱酯酶活性影响因素的研究
基于分光光度法（DTNB 法），对抑制乙酰胆碱酯酶活性测定方法的条件进行了优
化。底物乙酰胆碱碘代物（AchI）在乙酰胆碱酯酶（AchE）的作用下分解，生成碘代胆
碱（Iodiccholine），碘代胆碱与显色剂 DTNB 迅速作用，生成在 412nm 下有光吸收的黄
色物质。在此反应过程中，需要扣除缓冲液、AchI、DTNB 等因素产生的光吸收对酶活
测定的影响。实验结果表明，在 412 nm 的条件下，缓冲体系本身的光吸收可忽略不计
（OD =0.0046）；DTNB 的光吸收值随时间的延长有缓慢增加，即 OD =0.003T+0.0812，
影响不可忽略；AchI 的光吸收值也会随时间的延长而增加，即 OD=0.0037T+0.0992，影
响不可忽略。
因此，只有在酶活测定时扣除 DTNB 及 AchI 非酶水解产生的光吸收，才能真正计
算出由酶催化反应所产生的光吸收值，提高对乙酰胆碱酯酶抑制率测定的准确性。其计
算公式为：抑制率 AchE=[OD 对照-(OD 样品-OD 本底)/OD 对照]×100%。
2 地鳖虫中抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的提取工艺优化
以乙醇为浸提溶剂，在浸提时间、浸提温度、料液比等单因素试验基础上，运用响
应面法优化了地鳖虫中抑制 AchE 活性物质的提取工艺条件，最终得出其最佳工艺条件
为浸提时间 5.1h、浸提温度 61.1℃、浸提料液比 20.3:1。在此条件下获得的粗提物对 AchE
酶活力的抑制率最高可达 27.7%。
3 抑制乙酰胆碱酯酶活性物质的分离及其组分的初步分析
地鳖虫乙醇提取物萃取所需最佳溶剂为乙酸乙酯，将一部分乙酸乙酯相配制成初始
浓度为 50 mg/mL 的样品，测其对 AchE 的抑制率为 59.78%；地鳖虫乙酸乙酯相硅胶柱
层析所需最佳洗脱溶剂为 S6～S9，即氯仿：甲醇（92:8、91:9、9:1、8:1），其洗脱组分
经浓缩后所得样品干重分别为 99.8mg、32.2mg、36.6mg、31.4mg，将其部分配制成初
始浓度为 25mg/mL 的样品，测其对 AchE 的抑制率分别为 50.12%、51.95 %、42.31%、
40.03%。选取其中含量及活性较高的洗脱组分 S6 进行制备型薄层富集分离，以确定其
中的物质组成，结果得到组分 F1～组分 F4，将其部分配制成初始浓度为 5mg/mL 的样品，
测其对 AchE 的抑制率分别为 10.25%、14.75 %、20.45%、15.37%。并将其部分样品进
行生物碱鉴定实验，得知四个组分中均含有生物碱类物质。再将各组分样品进行 GC/MS
分析，可得到各组分样品中所含物质的分子量。组分 F1～F4 包含的含氮化合物分别为 6
种，6 种，7 种，6 种；其中氮氧化合物分别为 4 种，5 种，6 种，5 种。
关键词：地鳖虫；乙酰胆碱酯酶；抑制率；提取；分离
目 录
摘 要…………1
Abstract ……3
第一章 前 言6
1.1 老年痴呆症的研究进展 6
1.1.1 老年痴呆症的危害 …6
1.1.2 老年性痴呆症的发病机理 …………6
1.1.3 国内外研究现状 ……8
1.2 地鳖虫的研究进展 …10
1.2.1 地鳖虫的活性成分 10
1.2.2 地鳖虫的药理作用 …11
1.3 研究的目的与意义……12
1.4 研究内容及技术路线…13
1.4.1 研究内容……………13
1.4.2 技术路线……………14
第二章 抑制 AchE 活性测定方法条件的优化…………15
2.1 方法……15
2.1.1 试剂15
2.1.2 仪器16
2.1.3 溶液配制……………16
2.1.4 测定波长的选择……16
2.1.5 缓冲体系本身的光吸收测定………16
2.1.6 DTNB 的光吸收测定16
2.1.7 AchI 非酶水解产生的光吸收测定…16
2.1.8 OD－时间曲线的测定17
2.1.9 OD－酶浓度曲线的测定…………17
2.1.10 AchE 抑制率的测定方法…………17
2.2 结果与讨论……………17
2.2.1 测定波长的选择……17
2.2.2 缓冲体系本身的光吸收测定………18
2.2.3 DTNB 的光吸收测定18
2.2.4 AchI 非酶水解产生的光吸收测定…19
2.2.5 OD－时间曲线的测定19
2.2.6 OD－酶浓度活曲线的测定…………20
2.2.7 AchE 抑制率的测定方法……………20
2.3 本章小结21
第三章 地鳖虫中抑制 AchE 活性物质的提取工艺优化…22
3.1 材料与方法……………23
3.1.1 原料……………23
3.1.2 试剂……………23
3.1.3 仪器……………23
3.1.4 方法……………23
3.2 结果与讨论……………25
3.2.1 浸提试剂对 AchE 抑制率的影响…25
3.2.2 浸提时间对 AchE 抑制率的影响…26
3.2.3 浸提温度对 AchE 抑制率的影响…26
3.2.4 料液比对 AchE 抑制率的影响……27
3.2.5 响应面实验分析及试验结果………27
3.2.6 响应面分析与优化…29
3.2.7 回归模型的验证……31
3.3 本章小结31
第四章 抑制 AchE 活性物质的分离及其组分的初步分析…………32
4.1 材料与方法……………33
4.1.1 原料 ……………33
4.1.2 试剂 ……………33
4.1.3 仪器 ……………33
4.1.4 抑制 AchE 活性组分的分离………34
4.2 结果与讨论……………37
4.2.1 地鳖虫不同萃取物对 AchE 抑制率的影响………37
4.2.2 TLC 展开剂的选择 …38
4.2.3 乙酸乙酯相不同洗脱组分对 AchE 抑制率的影响39
4.2.4 乙酸乙酯相洗脱组分 S6 的薄层分析39
4.2.5 乙酸乙酯相洗脱组分 S6 的薄层富集分离及验证实验……………40
4.2.6 生物碱检识结果……41
4.2.7 组分 F1～F4 的 GC-MS 联用分析结果……………41
4.3 本章小结44
第五章 总结与展望………46
5.1 结论……46
5.2 展望
…47
参考文献……48
致 谢 ………51
攻读硕士期间发表的论文…52