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硕士论文-转Bt玉米对土壤微生物的影响及土壤中Bt蛋白降解规律的研究，共79页，46935字
摘 要
近年来，转Bt玉米的全球大规模商品化生产蓬勃发展，转Bt玉米长期种植，Bt毒蛋
白可通过根系分泌物、秸秆还田、残茬分解以及花粉飘落等进入土壤生态系统并积累和
富集，可能会影响土壤微生物群落的组成和结构，改变土壤的微生物多样性。而土壤微
生物是土壤生态系统中物质循环和能量转化的动力来源，温室和盆栽条件下很难反映土
壤微生物系统的真实情况，因此，研究田间自然状态下转Bt玉米对土壤微生物群落及多
样性的影响对Bt玉米的生态风险评价有着极为重要的意义。
本试验于2008年和2009年连续两年大田种植转Bt玉米和非Bt玉米，利用玉米苗期、
拔节期、喇叭口期、抽雄期、抽丝期、乳熟期和完熟期的根际土壤及秸秆还田后不同时
间采集的土样来分析大田自然状态下土壤微生物群落的变化，以及是否受到转Bt基因玉
米Bt蛋白的影响。主要研究方法为PCR-DGGE分析法、Biolog法和传统的微生物分离培
养法，酶联免疫法（ELISA）检测Bt蛋白。
1.通过 PCR-DGGE 法分析了 Bt 玉米和非 Bt 玉米对土壤微生物群落遗传物质的多样
性影响是否有差别，随后的克隆和测序进一步确定了土壤微生物群落中的主要细菌种类
及特异性的细菌种类。PCR-DGGE 对细菌 16s rRNA 的 V3 区进行扩增结果表明在玉米
各生育期根际土壤以及秸秆还田后土壤中的微生物 DNA 均得到了高效扩增，可分辨
DGGE 图谱条带在 30-40 条之间。不同生育期之间部分 DGGE 图谱之间有一定变化，在
各时期 Bt 玉米与非 Bt 玉米土壤微生物群落的遗传物质组成没有明显差异，仅在个别时
期内 Bt 玉米与非 Bt 玉米相比出现了或者缺失了某种特定的细菌种类。
对 DGGE 凝胶中检测到的细菌部分条带所代表的 51 条 DNA 序列进行系统分析显
示，共涉及主要细菌门类有变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚
壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、
拟杆菌门（ Bacteroidetes）、热脱硫杆菌门（Thermodesulfobacteria）和硝化螺旋菌门
（Nitrospirae）。
2. 利用 Biolog 法研究 Bt 玉米和非 Bt 玉米对土壤微生物利用不同碳源能力的差别，
以期反应土壤微生物的代谢功能活性是否受到 Bt 玉米的影响。检测结果显示，在玉米
生育期和秸秆还田后的土壤微生物培养中，非 Bt 玉米的 AWCD 值和群落多样性指数（H，
E，S）均普遍大于 Bt 玉米，表现出较强的代谢功能活性。Biolog 所反映的细菌群落功
能多样性受玉米基因型的影响较大。
3. 利用酶联免疫法（ELISA）对2009年玉米生育期和秸秆还田后Bt蛋白在土壤中的
残留和降解动态进行研究。检测结果证明，Bt玉米七个生育期内根际土壤的Bt蛋白随生
育期的变化差异较大，没有明显的规律性。Bt玉米秸秆分解释放的Bt蛋白在土壤中的降
解前期十分迅速，但中后期十分缓慢。对Bt玉米秸秆地上处理和地下处理释放的Bt蛋白
在土壤中的降解动态分别进行拟合证明，双指数模型要优于移动对数模型及指数模型，
更符合实际降解动态。
4. 运用传统方法对根际土壤细菌、真菌和放线菌以及七种功能细菌进行分离培养结
果表明，各生育期内 Bt 玉米与对照相比根际土壤真菌无显著差异，但细菌在抽丝期，
放线菌在苗期二者有显著差异。同种细菌功能群的数量变化在 Bt 玉米和对照各生育期
内趋势一致，不同的菌群表现不同。整个生育期内 3 种群落特征参数均保持基本稳定，
除乳熟期和完熟期外，Bt 玉米根际微生物群落特征参数均高于对照。
综之，大田条件下转 Bt 玉米的种植对土壤微生物产生了一定的影响，如微生物代谢
活性降低，个别生育期某特定细菌的出现或者缺失。但土壤微生物是一个复杂的系统，
其与 Bt 玉米 Bt 蛋白的交互作用可能是一个长期渐进的过程，因而仍需要对其进行长期
而细致的观察和试验。
关键词：Bt玉米；Bt蛋白；土壤微生物；遗传多样性；代谢多样性；群落多样性
目录
摘 要 .................................. 1
Abstract.................................. 3
第一章 前 言 .............................. 5
1.1 转 Bt 基因作物研究现状 ........................... 5
1.1.1 转基因作物生态安全评价研究现状 ...................... 5
1.1.2 转 Bt 玉米土壤生态安全评价研究现状 .................... 5
1.2 土壤微生物多样性研究方法现状 ..................... 7
1.2.1 传统分离培养法 .......................... 8
1.2.2 生物标志物法 .............................. 8
1.2.3 Biolog 微平板法............................ 9
1.2.4 现代分子生物学方法 .......................... 9
1.3 转 Bt 作物 Bt 毒蛋白在土壤中的残留和降解规律的研究.............11
1.3.1 转 Bt 作物 Bt 毒蛋白在土壤中的残留和降解状况..................11
1.3.2 土壤中转 Bt 毒蛋白的检测方法 ...................... 13
1.4 研究目的和内容 ........................... 13
第二章 应用 DGGE 法研究转 Bt 玉米生育期及秸秆还田后根际土壤微生物群落的变化 ..... 15
2.1 材料与方法 ............................... 16
2.1.1 材料与试剂 ............................. 16
2.1.2 主要仪器 ............................ 16
2.1.3 试验设计 ............................ 16
2.1.4 根际土壤微生物总 DNA 的提取及纯化.................. 17
2.1.5 PCR 扩增 ............................ 18
2.1.6 PCR 产物的变性梯度凝胶电泳分析（DGGE）................. 18
2.1.7 DGGE 图谱中特异条带 DNA 序列的克隆与测序分析 .............. 19
2.1.8 数据分析 ............................ 20
2.2 结果与分析 ............................... 20
2.2.1 根际土壤微生物总 DNA 的提取及 PCR 扩增结果................ 20
2.2.2 PCR-DGGE 图谱分析 ........................... 21
2.2.3 DGGE 图谱中条带的测序分析..................... 30
2.3 讨论 ............................... 36
第三章 应用 Biolog 法研究转 Bt 玉米生育期及秸秆还田后根际土壤微生物群落的变化...... 38
3.1 材料与方法 ............................... 39
3.1.1 材料与试剂 ............................. 39
3.1.2 主要仪器 ............................ 39
3.1.3 试验设计 ............................ 39
3.1.4 数据分析 ............................ 40
3.2 结果与分析 ............................... 40
3.2.1 转 Bt 玉米种植后土壤微生物群落功能多样性的变化............... 40
3.2.2 转 Bt 玉米种植后土壤微生物群落多样性指数的变化............... 44
3.3 讨论 ............................... 45
第四章 转 Bt 基因玉米 Cry1Ab 蛋白田间残留及降解规律的研究 ........... 47
4.1 材料与方法 ............................... 48
4.1.1 材料与试剂 ............................. 48
4.1.2 主要仪器 ............................ 48
4.1.3 试验设计 ............................ 48
4.1.4 Bt 蛋白含量的测定 ............................ 49
4.1.5 Bt 玉米秸秆还田后 Bt 蛋白降解的模型拟合 .................. 49
4.1.6 数据分析 ............................ 50
4.2 结果与分析 ............................... 50
4.2.1 Bt 玉米生育期根际土壤 Bt 蛋白的残留 .................. 50
4.2.2 Bt 玉米秸秆还田后 Bt 蛋白的降解 ...................... 50
4.2.3 Bt 玉米秸秆还田后 Bt 蛋白的降解模型拟合 .................. 51
4.3 讨论 ............................... 53
第五章 转 Bt 基因玉米根际微生物和细菌生理群多样性............... 55
5.1 材料与方法 ............................... 56
5.1.1 试验材料 ............................ 56
5.1.2 试验设计 ............................ 56
5.1.3 测定方法 ............................ 56
5.1.4 统计分析 .............................. 56
5.2 结果与分析 ............................. 56
5.2.1 田间自然条件下玉米根际土壤三大微生物数量的变化............... 56
5.2.2 田间自然条件下玉米根际细菌功能生理群的数量变化............... 58
5.2.3 转 Bt 基因玉米根际细菌功能类群的多样性特征................. 59
5.3 讨
论 ............................. 60
5.3.1 转 Bt 基因玉米对土壤微生物群落的影响 .................... 60
5.3.2 转 Bt 基因玉米对根际细菌功能类群多样性的影响................. 61
第六章 结论 ................................ 62
参考文献 .............................. 63
致谢 ................................ 69